基于金納米粒子的光學生物傳感方法研究進展

廖小飛，賴余芬，凌連生，鄒 李*

(1.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275)

金納米粒子(Gold nanoparticles，AuNPs)是近些年研究最為廣泛的納米材料之一，主要采用檸檬酸鈉還原法合成，通過控制成核制備不同粒徑的AuNPs[1-3]。由于AuNPs的表面等離子體共振性質，不同粒徑的AuNPs會呈現出不同顏色，這為AuNPs的應用奠定了科學基礎[4-5]。AuNPs不僅制備過程簡單，擁有獨特的光電效應，還具有較大的比表面積和良好的生物相容性，使得修飾在其表面上的生物分子可以保持良好的活性。利用某些官能團(如巰基、氨基等)與AuNPs表面具有的較強親和力，可將生物分子(如核酸、蛋白質和抗體等)修飾到AuNPs表面上，以AuNPs探針作為分子識別元件，可以構建多種形式的生物傳感方法[6-7]。

自1962年Clark首次提出生物傳感的概念以來，生物傳感技術得到了快速發展[8]。根據信號轉換的不同，可分為電化學生物傳感[9]、光學生物傳感[10]、熱學生物傳感[11]、場效應管生物傳感[12]和壓電晶體生物傳感[13]等。其中，光學生物傳感是將分析物與分子識別元件之間反應產生的信號，轉化成可供檢測的光學信號，從而實現對目標物的分析檢測[14]。鑒于AuNPs具有獨特的光學性質，因而被廣泛應用于光學生物傳感方法的構建。基于AuNPs的光學生物傳感方法具有特異性好、靈敏度高、響應快速、操作簡便、可現場即時監測等優點，在藥物分析[15]、醫學檢驗[16]、環境監測[17]及食品安全[18]等領域的快速檢測中具有廣闊的應用前景。本文綜述了近年來基于AuNPs的比色生物傳感法、熒光生物傳感法、電化學發光生物傳感法和光散射生物傳感法的研究進展(圖1)，旨在為基于AuNPs的光學生物傳感方法的進一步發展應用提供參考。

1 基于AuNPs的比色生物傳感法

AuNPs能在可見光區產生表面等離子體共振(SPR)吸收，且吸收峰的位置與顆粒之間的距離及粒徑大小有關[19]。當顆粒間的距離小于AuNPs的粒徑時，顆粒會發生團聚，其SPR吸收峰發生紅移，同時AuNPs溶液由紅色變為藍色，由此可構建出各種形式的比色生物傳感方法[20]。未經修飾的裸AuNPs具有較高的表面自由能而導致其穩定性較差，單鏈DNA(ssDNA)可通過靜電力吸附在AuNPs表面形成保護層，防止AuNPs在高離子強度下發生團聚。而雙鏈DNA (dsDNA)具有剛性結構，不易吸附在AuNPs表面，在高離子強度下AuNPs周圍的雙電層被破壞，使AuNPs發生團聚[21]。根據AuNPs對單雙鏈DNA的吸附力不同，Kim等[22]將土霉素的適配體吸附在AuNPs表面上防止其團聚，當土霉素存在時，適配體會與其特異性地結合而從AuNPs表面解離，失去適配體保護的AuNPs發生聚集顯色變化。Liu等[23]設計了2個帶有ssDNA粘性末端的發夾輔助探針，可以有效地穩定AuNPs，當靶DNA存在時可觸發2個發夾輔助探針發生級聯雜交反應，形成帶缺口的長鏈狀dsDNA。新形成的dsDNA聚合物沒有ssDNA粘性末端，當鹽離子濃度增加時，AuNPs發生聚集，呈現紅色到藍色的顏色變化。以上策略通過簡單的靜電吸附作用，無需復雜和昂貴的AuNPs表面修飾即可實現檢測分析的應用，但該法選擇性較差，易受外界干擾導致穩定性不夠理想。

AuNPs可以通過Au-S鍵與帶巰基的ssDNA牢固結合，以此作為探針與目標DNA發生特異性雜交反應，拉近AuNPs之間的距離而發生團聚。溶液顏色由紅色變為藍色，相應的SPR吸收峰也發生紅移[24]。Lee等[25]將2條ssDNA通過Au-S鍵修飾到AuNPs表面作為探針，利用T-Hg2+-T錯配來誘導2種AuNPs探針結合，使AuNPs發生團聚，導致溶液顏色由紅色變為藍色，從而實現對Hg2+的可視化檢測。為進一步提高AuNPs比色傳感法的靈敏度，Ling課題組通過引入多種核酸放大技術，開發了一系列高靈敏的比色生物傳感方法：①基于聚合酶鏈反應(PCR)產物可誘導DNA功能化的AuNPs組裝成交聯網狀結構，建立了一種靈敏、通用的DNA檢測方法[26]；②以DNA修飾的AuNPs為探針，利用脫氧核酶催化切割和雜交鏈式反應(HCR)雙重放大技術，通過DNA雜交反應將AuNPs-DNA探針組裝到HCR產物上，構建了一種高靈敏度的比色傳感平臺，并用于血清中乙酰膽堿酯酶活性分析及其抑制劑的篩選[27]；③將目標物驅動的催化發夾組裝(CHA)技術與AuNPs-DNA探針相結合，設計了一種可用于復雜體系的無酶比色傳感方法[28]。通常，生物標志物微量存在于人體中，利用比色法直接檢測的效果往往不理想，通過引入各種核酸放大技術可將檢測信號放大，提高靈敏度，避免假陰性。此外，AuNPs除了常與核酸適配體結合之外，還能與蛋白質通過靜電吸附或共價鍵結合用于免疫標記，其中膠體金標記層析法是通過將抗原或抗體固定到AuNPs表面，抗原和抗體的特異性結合會導致AuNPs大量聚集，通過肉眼即可觀察到明顯的顏色變化。此法目前已發展成為診斷試紙條，使用十分方便[29-30]。

基于AuNPs的比色生物傳感法是目前研究應用最為廣泛的光學生物傳感方法之一，其具有可視化、操作方便、能夠現場快速實時檢測等優勢，但易受體系中離子濃度、pH值、溫度、顏色背景等的影響，導致結果的穩定性和重現性較差。在未來的運用中可以引入更多的信號放大或輸出方式，以提高其檢測能力和擴大應用范圍。

2 基于AuNPs的熒光生物傳感法

AuNPs具有較高的消光截面和表面電子密度的性質，當熒光基團與其接近時，可通過偶極表面相互作用使熒光基團的能量有效轉移到AuNPs表面使熒光猝滅[31]。熒光生物傳感法是根據識別探針與待測底物之間的熒光共振能量轉移(FRET)，并伴隨著熒光信號的強弱變化及譜帶遷移，可以實現對待測物質的間接分析檢測[32]。Lv等[33]在赭曲霉毒素A(OTA)適配體的5'-端標記羧基熒光素，以AuNPs作為熒光猝滅劑，當體系中無OTA存在時適配體被吸附在AuNPs表面，其熒光信號被AuNPs猝滅。當體系中存在OTA時適配體與OTA結合形成折疊結構，可抵抗AuNPs的吸附從而恢復熒光信號。由于在適配體上標記熒光物質具有操作繁瑣和成本較高的缺點，Zhou等[34]直接將甲胎蛋白(AFP)適配體修飾的發光CdTe量子點(CdTe QDs)作為供體，抗AFP抗體修飾的AuNPs作為受體，設計了通過二者之間熒光共振能量轉移來檢測AFP的免標記熒光生物分析方法。

另外，在生物傳感體系中采用雙重或多重信號輸出的方式可以進一步提高檢測分析的準確性[35]，Shi等[36]提出了一種基于碳量子點(CQDs)和AuNPs的比色和熒光雙檢測的納米傳感系統，可用于人血清中谷胱甘肽(GSH)的檢測。其中CQDs作為熒光指示劑，AuNPs作為比色指示劑和熒光猝滅劑，在AuNPs溶液中加入CQDs后會引起AuNPs聚集顯色，CQDs熒光猝滅。然而，當GSH存在時可以保護納米粒子不聚集，擴大粒子間距離，從而產生顏色變化和熒光信號恢復。該生物傳感器簡單靈敏，制備的納米粒子無需表面功能化，且對GSH有高度選擇性，檢出限(LOD)低至50 nmol/L。由于熒光具有很強的穿透性，在細胞或者微生物的成像檢測方面也有巨大的應用優勢[37]，Wu 等[38]設計了一種新型的靜電DNA納米組裝結構，并將其用于活細胞內mRNA的超靈敏成像分析。DNA納米組裝結構由AuNPs、陽離子肽夾層以及熒光基團標記的發夾DNA探針利用靜電作用組裝，通過不依賴胞吞作用的獨特機制，DNA 納米組裝結構能夠克服溶酶體的捕獲，使DNA探針的細胞轉運效率較高。細胞內的mRNA則可以引發由靜電作用組裝的DNA探針從納米組裝結構中釋放，再通過雜交鏈式反應提供足夠的信號放大，實現mRNA表達的超靈敏熒光檢測。

在基于AuNPs的熒光生物傳感體系中，AuNPs通常作為熒光猝滅劑，可以猝滅各種熒光素或納米材料的熒光信號。與比色檢測方法相比，其能夠排除有色樣品的背景干擾，具有更高的靈敏度和抗干擾能力，使其成為分析化學領域的一個研究熱點。

3 基于AuNPs的電化學發光生物傳感法

AuNPs不僅有獨特的光學性質，還具有良好的電子傳遞能力和催化活性，將AuNPs修飾到工作電極表面上可以催化電化學反應，以此提高電子的轉移速率和增強發光信號[39]。電化學發光(ECL)是指在電極表面通過電化學反應實現電子轉移，促使物質形成激發態，再由激發態向基態躍遷并發光[40]，故通常需加入化學發光劑，如有機小分子(魯米諾及其衍生物等)[41]、金屬有機配合物(三聯吡啶釕及其衍生物等)[42]和量子點[43]等參與反應。與普通化學發光相比，基于AuNPs的ECL傳感方法可實現反應可控、信號放大及重復使用，在核酸分子、蛋白質、病原體、細胞等檢測中的應用更為廣泛。Cao等[44]用AuNPs功能化的氧化石墨烯(GO@AuNPs)、葡萄糖氧化酶(GOx)與鏈霉親和素(SA)對魯米諾基ECL系統進行研究，構建了一種新型的競爭性ECL檢測方法。在電極上修飾AuNPs可獲得較強的初始ECL信號，再將GOx和SA-DNA加載到GO@AuNPs上制備信號探針，用于實現信號放大。在無目標物的情況下，通過適配體與SA-DNA的雜交反應，可將信號探針附著在電極上。在這種狀態下，負載在探針上的GOx可以催化葡萄糖產生H2O2，然后AuNPs催化H2O2生成活性氧來氧化魯米諾發光。在此基礎上，Cao等[45]進一步設計了一種以硫化鎘@納米金-石墨相氮化碳(CdS@Au-g-C3N4)為光活性基質，氧化石墨烯-硫化銅@抗體(GO-CuS@Ab)復合物作為信號放大標記的三明治型ECL免疫傳感系統。其中，AuNPs作為等離子體光敏劑和電子繼電器，可以顯著促進對光的吸收，加速g-C3N4和CdS之間的電荷轉移。Cao等構建的兩種ECL檢測方法已成功用于前列腺特異性抗原(PSA)的檢測，檢出限均低于1 pg/mL。

ECL生物傳感法結合了電化學與化學發光的優點，具有靈敏度高、穩定性高、可控性好、檢測時間短、檢測范圍寬等特點。與熒光生物傳感法相比，ECL生物傳感法無需外界的光源激發，而是在電極表面實時原位產生光信號，因此消除了光散射和自發光的背景干擾，使得檢測結果更為準確，已發展成為一個非常活躍的研究領域。

4 基于AuNPs的光散射生物傳感法

AuNPs除了具有SPR吸收，顆粒之間還存在長程的等離子體共振耦合作用，使AuNPs間隙的局域電磁場會顯著增強，從而導致拉曼信號明顯增強[48]。通常待測物質自發的拉曼散射信號非常弱，但當其固定在粗糙金屬表面時存在電荷轉移，可以顯著增加其拉曼散射強度[49]。基于AuNPs的表面增強拉曼散射(SERS)傳感方法可通過捕捉AuNPs自身拉曼散射強度的變化來間接檢測目標物。Lu等[50]將抗體修飾在AuNPs表面，設計了一種利用AuNPs表面增強共振拉曼散射的免疫層析條，可以快速、靈敏地檢測血清中的抗原物質，此法比常規酶聯免疫吸附法的檢出限低10倍，具有潛在的臨床應用價值。Fu等[51]通過在AuNPs表面修飾寡核苷酸和孔雀石綠異硫氰酸酯(MGITC)，作為SERS納米標記并用于常規層析條上，由于MGITC具有很強的拉曼增強效應而被用作拉曼報告分子。該法通過記錄測試線上的拉曼強度變化對目標物進行定量檢測，比直接使用裸AuNPs的拉曼信號更加靈敏，比傳統比色或熒光檢測方法的靈敏度至少高1 000倍。

SERS信號強烈依賴于分析物分子與金屬納米結構間的相互作用和距離[52]，Hu等[53]將AuNPs嵌入金屬-有機骨架(MOF)中用于高靈敏度的SERS檢測，合成的金納米粒子/拉瓦錫骨架(AuNPs/MIL-101)納米復合材料結合了AuNPs的局域SPR特性和MOF的高吸附能力，當分析物接近活性金屬表面時電磁場發生明顯改變，使其成為高度敏感的SERS襯底。另外，通過將AuNPs組裝到物質界面上也可形成良好的表面增強拉曼基底，極大提高檢測靈敏度[54]。Zhu等[55]直接將AuNPs修飾到聚二甲基硅氧烷薄膜上，采用巰基苯甲酸和適配體修飾的金銀核殼納米粒子(Au@AgNFs)作為信號探針，在目標物存在的情況下，通過形成底物-目標物-分子探針的三明治結構實現精準檢測。在實際樣品檢測中，拉曼光信號往往會受到其他成分的干擾，Zhang等[56]則提出了一種以四氧二鐵酸鈷@埃洛石納米管/金納米粒子(CoFe2O4@HNT/AuNPs)為基底，采用磁固相萃取技術測定化妝品中禁用添加劑的靈敏SERS傳感方法。該法能有效簡化實際樣品的預處理，增強拉曼信號，減少樣品基質的影響。

在光散射技術中，除了拉曼散射外，動態光散射(DLS)也被廣泛應用。DLS是基于粒子的布朗運動引起散射光強度波動，來確定其尺寸大小和粒徑分布。利用功能化的AuNPs探針特異性捕獲目標物，誘導AuNPs發生聚集，從而可以通過DLS實現對目標物快速靈敏的檢測[57-58]。Dai等[59]基于DLS技術設計了一種可單步檢測DNA的方法，即當2個DNA功能化的AuNPs探針混合在含有互補靶DNA的樣品溶液中時，靶DNA與2個納米粒子探針雜交，導致納米粒子形成二聚體、三聚體和多聚體，然后通過DLS技術進行檢測。該法簡單實用，但缺少必要的信號放大過程，為了進一步提高DLS檢測的靈敏度，Ling課題組開發了一系列動態光散射結合核酸放大技術的生物傳感策略，首先構建了聚合酶鏈式反應-動態光散射(PCR-DLS)的生物傳感方法，用于艾滋病病毒(HIV)的靈敏檢測，即當目標DNA存在時會使PCR過程中引物的發夾結構打開，生成的PCR產物兩端帶ssDNA片段，進一步與DNA修飾的AuNPs探針發生雜交，誘導AuNPs發生聚集使其粒徑增大，DLS測量的粒徑會隨著目標DNA濃度的增加而增大[60]；還構建了雜交鏈式反應-動態光散射(HCR-DLS)和催化發夾自組裝-動態光散射(CHA-DLS)的無酶生物傳感方法，可用于腫瘤細胞中端粒酶的高靈敏檢測[61-62]。

與傳統比色法相比，基于AuNPs的光散射生物傳感法克服了檢出限高、有色底物的背景干擾、難以獲取微量聚集信號等缺陷，具有無損快速、靈敏度高、重現性好、測量范圍廣及易于操作等優勢，在核酸、多肽、抗體、細胞和微生物等生化分析中具有很好的應用價值，已在傳感領域中越來越受到關注。總之，基于AuNPs的光學生物傳感方法各具特色，在實際運用中需要根據具體的檢測目標物并結合AuNPs的相關性質予以考慮。表1總結了此文所涉及的各類光學生物傳感方法的相關應用情況。

表1 基于AuNPs的光學生物傳感方法在分析檢測中的應用Table 1 Applications of AuNPs-based optical bio-sensing methods

5 總結與展望

生命科學和納米技術是當今科學研究的兩大熱門領域，隨著生物技術和納米材料的不斷相互交叉滲透，生物傳感方法的研究應用得到了極大的發展。AuNPs易于合成和表面修飾，具有獨特的光電效應和良好的生物相容性，使其在光學生物傳感方面得到廣泛應用。本文圍繞AuNPs獨特的光學性質，分別介紹了基于AuNPs的比色生物傳感法、熒光生物傳感法、電化學發光生物傳感法和光散射生物傳感法的研究進展。基于AuNPs的光學生物傳感方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強及檢測速度快等優勢，已被廣泛應用于生物醫學、藥物分析、環境監測和食品安全等領域。

但是，基于AuNPs的光學生物傳感方法還有待進一步提高，如檢測體系的背景干擾、檢測信號低，在復雜體系中的抗干擾能力不夠理想及局限于體外分析等。此外，其檢測結果的穩定性也有待提升，在構建通用型的生物傳感系統方面仍存在很多挑戰，還需將更多的納米材料、信號放大技術和輸出方式等引入到傳感系統中以拓寬其使用范圍。未來的生物傳感技術將會朝著智能化、微型化、集成化與多功能一體化的方向發展。另外，實驗室開發的新型生物傳感方法轉化為廉價高效、便攜實用的產品，并逐步實現商品化和產業化將成為一種必然趨勢。