高壓靜電場對小鼠骨組織鈣沉積的影響

溫沛 張鵬翔 李成興 楊丁 原佳慧 羅小毛 劉振宇 王海東

摘要：為了探討正負高壓靜電場對小鼠骨骼組織的影響，將21 只健康C57BL/6小鼠隨機分為正高壓靜電場組A、負高壓靜電場組B以及空白對照組C。A、B組分別置于電場強度為1.2 kV/cm的正、負高壓靜電場中，于7、14、21 d取小鼠兩側股骨。結果表明，正、負高壓靜電場組與對照組相比，骨小梁的密集程度顯著升高（P<0.01）、骨鈣濃度及血鈣濃度上升（P<0.01）。一定強度的高壓靜電場增加了骨小梁密集程度，引起骨鈣及血鈣濃度上升，對骨小梁的形成和骨組織鈣化具有促進作用。

關鍵詞：高壓靜電場;成骨細胞;骨小梁;骨鈣;血鈣

中圖分類號： S858.91 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0146-04

電場（electric field）是電荷及變化磁場周圍空間里存在的一種特殊物質，對放入其中的電荷有力的作用[1]。地球作為生物機體賴以生存的環境，其表面攜帶有負電荷，而大氣層則攜帶正電，使地球本身形成靜電場[2]，各種生物的生存繁衍、生長發育均適應于地球這一靜電場下[3]。自18世紀中葉靜電場的生物效應被發現后，利用高壓靜電場輻照處理植物種子以提高種子活力的研究十分廣泛，在玉米、水稻、棉花等作物及瓜果蔬菜方面均有應用[5]。

高壓靜電場不僅對植物的生長發育有利，對動物也有一定作用[8]。研究發現，高壓靜電場能影響動物的體質量、血壓、血糖及超氧化物歧化酶等生理指標[9]，并對動物機體的免疫系統產生作用。此外，有研究表明，電能可促進骨的生長與修復，但臨床治療使用的主要方式是用直流電直接刺激骨折部位，進而促進骨骼的愈合[10]。而高壓靜電場能否促進骨組織的生長發育，目前尚無研究。骨骼作為機體的支架，也是運動系統的重要組成部分，骨基質中無機成分主要是羥磷灰石結晶[Ca10（PO4）6（OH）2][11]，骨鈣的代謝將直接影響骨的質量，從而影響機體正常生命活動[12]。理論上，靜電場會對其內所有離子產生力的作用，即使是體內的Ca2+也不能例外，但目前并沒有研究報道高壓靜電場影響Ca2+在動物體內的代謝以及調節骨基質中羥磷灰石結晶形成的作用。

本試驗主要研究高壓靜電場作用下對小鼠骨組織骨鈣沉積和血鈣變化在成骨過程的影響，證明高壓靜電場對小鼠骨組織的影響，以期為進一步探究高壓靜電場對骨性疾病治療作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑與儀器 鈣試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）;蘇木精、伊紅染液及中性樹脂（北京索萊寶科技有限公司）;斯瑪特全自動生化分析儀（成都斯瑪特科技有限公司）;高壓直流電源[東文高壓電源（天津）股份有限公司]。

脫鈣液由100 g EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二鈉）溶于1 L 磷酸緩沖鹽溶液中，加入NaOH攪拌溶解后用HCl調節溶液pH值至7.2制成。骨固定液由8 mL 3%戊二醛和8 mL 4%多聚甲醛混合，加入 4 mL 4%組織固定液制成。

1.1.2 試驗動物 選用C57BL/6的5周齡雄性小鼠，購自山西醫科大學實驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗系統 試驗地點位于山西農業大學動物醫學國家級實驗教學示范中心，小鼠每日給予光照、黑暗各12 h，飼養環境溫度保持在（25±0.5） ℃，濕度為50%～60%，自由飲水和采食。適應性飼養1周后隨機分為3組，其中2組分別置于正高壓靜電場、負高壓靜電場下繼續飼養3周，每日輻照12 h后正常飼養，另1組設為對照組。正、負電場場強均穩定在1.2 kV/cm。試驗時間為2019年10月至2020年1月。

1.2.2 取樣與固定 分別于試驗7、14、21 d從3組中隨機選取3只小鼠，摘取眼球采集血液，后脫頸處死，取其兩側股骨。血樣以4 000 r/min、4 ℃離心10 min后分離血清，置于-20 ℃保存，用于血鈣測定。將一側股骨置于4%多聚甲醛固定24 h后，置于10% 脫鈣液中，脫鈣3周，定期更換脫鈣液直至骨組織變軟，截取2/3遠端股骨做石蠟包埋切片。另一側股骨于-80 ℃保存，用于骨鈣含量測定。

1.2.3 脫鈣組織的制片和觀察 取1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的脫鈣骨骼組織，以大頭針順利插入骨骼組織作為脫鈣終點的判斷依據，流水沖洗8 h。梯度乙醇脫水（70% 2 h，80% 2 h，90% 1 h，95% 1 h，100% 45 min）、二甲苯透明（45 min），浸蠟3 h后包埋，以7 μm厚度切片，50 ℃烤片機烘干。組織切片依次用二甲苯、梯度乙醇、蘇木精、伊紅染液、中性樹脂，對組織脫脂、染色、封片。顯微鏡下觀察骨組織的形態結構，使用Image-Pro Plus統計骨小梁的面積占比。

1.2.4 骨鈣濃度的測定 將保存于-80 ℃的骨組織取出稱質量，加入生理鹽水，研缽研磨，靜置5 min后，以2 500 r/min的速度4 ℃離心10 min，取上清液待測。在96孔板中加入對應試劑和樣本，混勻后，靜置5 min，在酶標儀610 nm處測定吸光度，繪制標準曲線計算濃度。

1.2.5 血鈣濃度的測定 將保存于-20 ℃的血清取出，取100 μL血清加入試劑盒中，置于全自動血液生化分析儀，測量并計算分析血鈣含量。

2 結果與分析

2.1 正高壓靜電場造成骨小梁比例增加

正高壓靜電場處理下的小鼠，骨組織HE（蘇木精伊紅染色）結果表明，對照組骨小梁分布均勻，密集程度較低。正高壓靜電場組深處可見骨髓腔中充滿大量的髓質骨小梁。正高壓靜電場組的骨小梁密集度較高、骨小梁周圍成骨細胞較多（圖1-A）。對骨組織形態進行統計學分析發現，正高壓靜電場組與對照組相比有顯著差異（圖1-B）。結果表明，正高壓靜電場組可增加骨骼內骨小梁和成骨細胞數量，從而促進成骨過程。

2.2 負高壓靜電場促進成骨發育

負高壓靜電場處理下的小鼠骨組織HE結果顯示，與對照組相比，負高壓靜電場組的骨小梁密集度較高、其周圍成骨細胞較多（圖2-A）。同樣對負高壓靜電場組進行骨組織形態統計，分析發現負高壓靜電場組與對照組相比具有顯著差異（圖2-B）。結果表明，負高壓靜電場處理會造成骨骼內骨小梁增加，促進成骨過程。

2.3 高壓靜電場引起骨鈣沉積

通過使用鈣試劑盒測量骨鈣濃度，結果（圖3）表明，與對照組相比，正、負高壓靜電場處理的小鼠骨鈣濃度均表現為顯著性升高。隨著正高壓靜電場處理時間的增加，骨鈣濃度呈現上升趨勢。負高壓靜電場則表現相反趨勢，即隨著處理時間的增加，骨鈣濃度呈現下降趨勢。結果表明，正高壓靜電場的長時間作用會導致骨鈣沉積增多，負高壓靜電場的長時間作用會導致骨鈣沉積量下降;但與對照組相比，正、負高壓靜電場處理均引起骨鈣沉積。

2.4 高壓靜電場影響血鈣濃度

由圖4可知，與對照組相比，高壓靜電場處理的小鼠血鈣濃度均有所升高。在正高壓靜電場處理時，不同時長下（7、14、21 d）均比對照組有微量升高趨勢，在21 d時濃度提升具有顯著性差異。負高壓靜電場處理結果與正高壓靜電場處理結果相似，血鈣濃度在21 d時表達升高，具有顯著性差異。用正高壓靜電場或負高壓靜電場處理組中，處理7 d和14 d小鼠的血鈣濃度均沒有表現出顯著的差異，但在21 d時顯著提高。高壓靜電場長時間作用對小鼠血鈣濃度的升高有一定的影響，而正高壓靜電場與負高壓靜電場在促進血鈣濃度方面沒有顯著區別。

3 討論與結論

骨小梁是由針狀或片狀的骨板及骨細胞構成的，對骨質的強度和硬度有重要的影響，是成骨過程重要的一環[11]。本試驗通過對骨小梁進行切片觀察及形態計量學統計分析，發現高壓靜電場處理顯著導致了骨小梁增加，說明在高壓靜電場的作用下會促使成骨細胞的增殖及其在骨鈣沉積中的作用。

細胞生物電是機體新陳代謝的物質基礎，高壓靜電場作為環境物理因素對生物體的影響實質上是外加電環境對細胞生物電轉變過程的影響[12]，細胞正是由于這些影響導致了一系列復雜的生理變化，最終致使其生命運動做出相應的調整[13]。有研究表明，外加高壓靜電場下影響細胞膜電位，使膜兩側離子濃度發生變化[14]。電壓門控的離子通道的活化對膜電位具有強烈的依賴性，在電場作用下，門控電流引起孔洞的構象變化，從而活化離子通道[15-16]。

人體內的血鈣會在成骨細胞的作用下，沉積在骨骼上形成骨鈣;骨鈣則會在破骨細胞的作用下，從骨鈣轉變為血鈣[17]。因此，血鈣濃度可以在一定程度上改變骨鈣沉積。本研究表明，與對照組相比，高壓靜電場處理組血鈣濃度普遍升高，這在一定程度上促進了骨鈣濃度的上升，試驗數據也表明了這一點，但短時間的處理未造成血鈣濃度的顯著性提升，說明高壓靜電場對血鈣濃度的變化需要長時間的作用。本次試驗說明高壓靜電場可以促進血鈣上升、骨鈣沉積。但短時間的高壓靜電場處理對血鈣濃度效果不顯著的原因可能是電場刺激過程中產生的低濃度臭氧影響了作用效果[18];長時間的負高壓靜電場處理下骨鈣濃度效果反而下降的主要原因可能是自然界通常處于低壓正靜電場狀態，外加負高壓靜電場會阻礙生物機體中原有的生理過程。本研究還有很多不足之處，首先不確定高壓靜電場是否會對動物其他生理指標產生影響，其次對高壓靜電場對成骨的影響機制也不清楚。整體來說，高壓靜電場在骨鈣沉積以及血鈣濃度的影響上有一定的作用，可以促進成骨分化，但須要控制適當的時間和適當的場強，有望成為在治愈骨折過程中重要的一個輔助手段。

本研究表明，高壓靜電場處理可以提高骨小梁的形成和骨鈣沉積，以及促進血鈣濃度上調，從而導致成骨分化和骨骼強度的增加。

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