高純度花青素制備關鍵技術創(chuàng)新及開發(fā)示范

何安樂 劉庚貴 黃華學 黃俊 熊瑤

【關鍵詞】高純度;花青素;關鍵技術;產業(yè)化;示范

【中圖分類號】TS264.4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2021）05-0045-04

花青素（Anthocyanidin）又稱為“花色素”，是一種水溶性黃酮類植物色素，存在于植物的細胞液中，常含于多種花、果、莖、葉的組織細胞中，如葡萄、藍莓、黑加侖、紫胡蘿卜、紫玉米、黑米、紫甘薯、紅甘藍等植物[1]。除了使植物的果實顯示美麗的顏色外，花青素還可被人體完全吸收且具有多種功效。花青素具有黃酮類結構，使其能夠清除體內自由基，避免人體的細胞和組織被氧化，加強皮膚的抗衰老能力，改善睡眠，保護心血管，并可預防高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、心腦血管疾病等自由基相關疾病的發(fā)生。美國農業(yè)部人類營養(yǎng)研究中心等研究機構認為花青素是當前已發(fā)現(xiàn)的最有效的水溶性抗氧化劑，其抗氧化活性遠高于維生素C和維生素E，并且無毒副作用[2]。因此，花青素的發(fā)現(xiàn)和應用使人類從20世紀的維生素時代進入21世紀的花青素時代。

目前，市場上的花青素主要以合成花青素為主，隨著醫(yī)學毒理學和生物學研究工作的深入開展，合成花青素被報道對人體有著不同程度的傷害。因此，應用天然花青素已成為市場趨勢。然而，受提純技術和產業(yè)化生產的限制，目前市場上天然花青素普遍存在著純度不高（25%）、產量不足等問題，嚴重制約了天然花青素產業(yè)的發(fā)展。有研究報道，花青素生理活性受到純度影響，如同量的高純度花青素的抗氧化能力要遠大于低含量花青素;低含量的花青素對腎臟中的GSH-Px酶活性無促進作用，而高純度花青素則能夠顯著促進該酶的活性，將體內的過氧化物有效轉換為毒害較低或無害的物質。因此，低純度花青素已不能滿足市場需求，而高純度花青素在化妝品、保健品、生物醫(yī)藥等領域有著更廣闊的市場，如化妝品行業(yè)中高檔化妝品要求花青素純度不低于65%。因此，實現(xiàn)高純度天然花青素的大規(guī)模產業(yè)化生產對花青素行業(yè)具有重要的推動作用。

1 前期研究基礎

1.1 天然花青素的性質

花青素性質較活潑，其極性較強，易相似相溶于極性較強的溶液中，不易溶于極性較低的溶液中。花青素遇醋酸鉛試劑會被沉淀析出，并能被活性炭吸附而丟失或失去活性。花青素在可見光區(qū)段和紫外光區(qū)段各有一個強吸收波長范圍，分別是500～550 nm和270～280 nm。花青素水溶液顏色受pH影響較大，一般在中性環(huán)境下為紫色，酸性環(huán)境下變紅色，堿性環(huán)境下變藍色[3]。

天然花青素一般是以陽離子形式存在，其基團缺少電子，因而使其具有較強活性。研究發(fā)現(xiàn)，花青素的平均尿排泄量為攝取劑量的0.03%～4%，消除半衰期為1.5～3 h。因此，花青素常表現(xiàn)出低的化學穩(wěn)定性和短的半衰期及相對低的生物利用度，加工或保存環(huán)境的pH、溫度、VC濃度、金屬離子、氧濃度等外界因素都會影響其穩(wěn)定性。在這些因素的作用下，花青素易解離、褐變或褪色，改變其溶液顏色和透明度，進一步阻礙花青素色素作為食用增色劑在食品、醫(yī)療美容等行業(yè)中的使用和發(fā)展[4]。故許多研究人員都開始研究通過更加簡單的工藝、更加溫和的提取純化條件提高花青素的穩(wěn)定性，以便擴大其使用范圍。

1.2 存在的主要問題及解決方案

1.2.1 大孔樹脂法是目前花青素行業(yè)通用的純化方法

大孔吸附樹脂（Macroporous Adsorption Resin）是一類不含交換基團的高分子吸附樹脂[5]，具有良好的大孔網狀結構和較大的比表面積，通過與被吸附物之間的范德華引力或生成氫鍵，選擇性地進行吸附，再經過被吸附物與洗脫劑之間的“相似相溶”作用，經一定配比的洗脫劑與大孔樹脂解吸附，從而達到與其他物質分離、提純的目的。大孔吸附樹脂穩(wěn)定性高、選擇性好、解吸附條件溫和、操作簡單、再生處理方便，因此大孔吸附樹脂法是目前國內外花青素行業(yè)中的純化通用方法。

1.2.2 雜質過多是導致現(xiàn)有大孔吸附樹脂法應用純化效率低、純化純度不高等的瓶頸問題

大孔吸附樹脂純化過程受大孔樹脂種類與極性、待純化化合物的結構與極性、洗脫劑的種類與極性、上藥液濃度、上樣流速、樹脂徑高比等多種因素影響。其中，大孔樹脂種類與極性、洗脫劑的種類與極性是影響純化效率的兩個因素，而它們的選擇及優(yōu)化皆是由待分離物的極性決定。一般而言，極性較大的物質一般適合在中等極性的樹脂上分離，用極性較大的洗脫劑洗脫;而極性較小的化合物適合在非極性的樹脂上分離，用極性較小的洗脫劑洗脫。目前，經大孔樹脂純化時普遍存在著花青素與多種雜質（葉綠素、糖類、酚類、有機酸等）共存的情況，嚴重影響了大孔樹脂極性和洗脫劑極性的選擇和優(yōu)化，限制了大孔吸附樹脂法的應用，導致花青素純化純度較低（25%），對花青素的療效和質量產生客觀上的負面效應。因此，如何在使用大孔吸附樹脂純化花青素之前，高效去除共存雜質是目前花青素產業(yè)中的技術難題。

1.2.3 “超臨界萃取+膜分離技術”除雜分離技術為現(xiàn)有大孔吸附樹脂富集純化花青素提供新的技術解決方案

本研究在前期工作基礎上，針對大孔吸附樹脂純化花青素純化效率較低、純化純度較低的問題對花青素提純技術進行創(chuàng)新，提出應用“超臨界萃取+生物有機納濾膜”除雜分離技術，將超臨界CO2萃取技術與膜分離技術相結合，構建除雜工藝參數(shù)數(shù)據(jù)庫，研究最優(yōu)的除雜技術控制參數(shù)，高效去除脂溶性雜質（葉綠素等）、大分子水溶性雜質（糖類、蛋白質、果膠等）及小分子水溶性雜質（酚類、有機酸等）;以除雜工藝參數(shù)數(shù)據(jù)庫為基礎，與大孔吸附樹脂純化技術相結合，研發(fā)高效提純花青素方法;建立一套完善的花青素質量標準體系，確保花青素質量的穩(wěn)定可控;最終開發(fā)出一套純化效率高、成本低廉、質量優(yōu)良的花青素純化設備，應用于花青素的產業(yè)化生產，顯著提高花青素的質量和產量，減少資源浪費，形成一系列知識產權的核心技術，有望從根本上解決現(xiàn)行花青素純度不高、產量不足這一共性問題，推動花青素產業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。

2 制備關鍵技術及產業(yè)化研究方法

2.1 研究路線

本研究對高純度花青素產業(yè)化的關鍵技術展開研究，通過構建花青素的除雜、純化工藝參數(shù)數(shù)據(jù)庫，開發(fā)獲得高純度花青素，并應用到花青素的產業(yè)化生產中。

高純度花青素的制備關鍵性技術及產業(yè)化，是以干玫瑰茄為研究對象，先利用超臨界二氧化碳技術對原料中的脂溶性物質進行脫除，然后通過連續(xù)逆流提取技術進行花青素的浸提而得到花青素浸提液，接著將得到的浸提液再過超濾膜，進一步除去顆粒性及大分子物質，為下一步層析做準備;經過超臨界與超濾膜除雜之后得到的浸提液調節(jié)酸堿度之后，上柱大孔吸附樹脂層析柱，飽和吸附后，利用不同濃度的乙醇進行洗脫，收集的洗脫液經過濃縮噴霧干燥后，即得到高純度花青素產品。工藝生產路線如圖1所示。

2.2 主要操作步驟

（1）原料的挑選：必須挑選無霉點、無腐爛、無異味、無砂石的干玫瑰茄為原料。

（2）投料：將玫瑰茄原料按稱重并投入超臨界裝置中，啟動設備，開始超臨界二氧化碳萃取。

（3）浸提：將經過萃取的玫瑰茄原料直接投入連續(xù)逆流設備中，同時設置溫度、流速，開始浸提，并收集浸提液。

（4）膜過濾：將得到的浸提液冷卻至室溫后，過超濾膜，注意膜溫度不要超過70 ℃，收集透過液。

（5）洗脫：將透過液冷卻后，調節(jié)pH值后以一定流速上柱與大孔吸附樹脂（大孔吸附樹脂提前活化），至流出液有紅色顯示時，停止上柱，并水洗，再用不同濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液。

（6）濃縮：將收集的洗脫液低溫濃縮至20 brix以上，注意濃縮溫度不高于70 ℃。

（7）干燥：將得到的濃縮液用噴霧干燥塔進行干燥，經過檢測打包，即得高純度花青素產品。

3 規(guī)模產業(yè)化研究

本研究在選定工藝流程及參數(shù)的前提下，匹配企業(yè)已有的生產設備，另購置陶瓷膜、納濾膜、離子柱等設備，進行管道等生產設備的改造，完成規(guī)模化生產線建設，實現(xiàn)綠色、高效、節(jié)能、可持續(xù)的規(guī)模化生產，最終完成高純度花青素綠色可持續(xù)生產技術的產業(yè)化應用。

將高純度花青素可持續(xù)生產技術進行產業(yè)化應用，對生產工藝進行小試、中試和規(guī)模生產研究，并根據(jù)最終生產工藝制備部分匹配的生產所需設備，實現(xiàn)綠色、高效、節(jié)能、可持續(xù)四大目標，實質性地推動我國在此領域的產業(yè)發(fā)展。

3.1 產業(yè)化放大研究

3.1.1 小試研究

高純度花青素的小試研究全部在實驗室進行，分別利用回流提取與濾布袋相結合代替車間連續(xù)逆流工藝中的浸提環(huán)節(jié)、利用小型超濾膜代替車間大型超濾膜組件、利用小型玻璃層析柱代替車間大型不銹鋼層析柱、利用旋轉蒸發(fā)儀代替車間三效蒸發(fā)濃縮器、利用真空干燥代替車間噴霧干燥;實驗室用超臨界設備是借用中南大學的試驗設備。

在小試過程中，設備操作簡單，實驗條件和過程可控性極強，整個小試實驗開展比較順利。譬如夾帶劑的選擇、浸提工藝的參數(shù)摸索、膜孔徑的選擇及大孔吸附樹脂對花青素的吸附量、真空干燥的溫度等條件。這都與最終規(guī)模化生產的數(shù)據(jù)極為接近。同時，在小試過程中研究發(fā)現(xiàn)幾個極為重要的環(huán)節(jié)，主要有溫度、pH值、層析柱上樣量、洗脫液濃度、膜孔徑大小等。

研究發(fā)現(xiàn)，無論是超臨界環(huán)節(jié)、浸提或濃縮干燥環(huán)節(jié)，溫度對花青素含量的影響最大，其任意一個環(huán)節(jié)的溫度的變化都會直接影響最終產品的含量，同時發(fā)現(xiàn)，整個生產工藝中體系的溫度不能超過70 ℃才能保證最終產品合格;pH值對花青素的影響也很大，趨于中性或堿性的花青素溶液極易發(fā)生降解，最終導致最后產品含量過低且使用弱酸-檸檬酸要遠高于強酸（鹽酸、硫酸等），并且發(fā)現(xiàn)在一定的酸性條件下花青素的穩(wěn)定性也隨之提高;層析過程中解吸液乙醇的濃度對產品的最終含量也極為重要，洗脫劑中乙醇濃度過低或過高，都會導致產品含量過低，乙醇濃度過高直接導致大量雜質也隨之被洗脫下來，乙醇濃度過低會導致花青素洗脫不完全，同時會給后續(xù)濃縮帶來壓力。

在小試過程中，通過實驗室現(xiàn)有儀器模擬車間的工藝設備，一方面優(yōu)化了各關鍵性工藝參數(shù)，另一方面也摸清了工藝過程中各環(huán)節(jié)對花青素產品的影響因素及關鍵控制點，這對后續(xù)試驗的二級放大和試生產提供了必不可少的基礎數(shù)據(jù)和經驗總結。

3.1.2 中試生產研究

中試生產是承接小試與規(guī)模上生產的必經之路，現(xiàn)有1 000多m2的中試車間，幾乎可以完全模仿規(guī)模化生產車間的生產過程。在中試過程中，以小試數(shù)據(jù)為基礎，將整個實驗進行放大，單次投料可達50 kg，主要以單效蒸發(fā)濃縮器替代旋轉蒸發(fā)儀模擬車間三效蒸發(fā)濃縮儀、以直徑20 cm的玻璃層析柱代替實驗室2.5 cm的玻璃層析柱模擬車間直徑2.5 m不銹鋼層析柱、以小型噴霧干燥塔代替實驗室真空干燥模擬車間大型真空噴霧干燥塔、以中型超濾膜替代小型超濾膜模擬車間大型的超濾膜組件。

中試生產的過程是以小試參數(shù)為基礎，重現(xiàn)小試實驗并模擬車間規(guī)模化生產過程，同時針對小試過程中發(fā)現(xiàn)的關鍵性環(huán)節(jié)進行把控，并盡可能地連續(xù)化實驗，最大限度地模擬產業(yè)化車間的生產過程，為下一步車間生產摸清控制關鍵點。

中試研究發(fā)現(xiàn)，溫度的控制依然是決定著最終產品是否合格的最重要環(huán)節(jié)，對溫度的不易把控，主要體現(xiàn)在超濾膜步驟中，超濾過程具有一定的壓力且截留液會在膜組件內部反復回流，長時間的超濾會直接導致膜組件及內部液體溫度升高，最高可到80 ℃，如果對超濾過程不加以嚴格把控，將嚴重影響整個生產過程;此外發(fā)現(xiàn)，在大孔吸附樹脂吸附層次過程中，由于柱體積較大，所以有時候可明顯看到色譜帶發(fā)生偏流，這會嚴重降低吸附樹脂的吸附率（即有些樹脂未吸附飽和，而有的樹脂已經吸附過量），這些現(xiàn)象在小試過程中都未發(fā)現(xiàn)，通過大量的中試試驗和經驗總結發(fā)現(xiàn)，發(fā)生偏流的主要原因有樹脂活化不完全、裝柱過程不均勻、上柱流速不穩(wěn)定等，任何一個環(huán)節(jié)的疏漏都會影響整個生產過程，為后續(xù)規(guī)模化生產提供了基礎數(shù)據(jù)和依據(jù)。

在中試過程中，除了溫度和層析對最終產品的影響較大處，還有噴霧干燥前濃縮液的濃度、單效蒸發(fā)濃縮器的真空度等，這些出現(xiàn)的問題都為后續(xù)規(guī)模化生產提供了寶貴的數(shù)據(jù)支撐。

3.1.3 規(guī)模生產研究

規(guī)模化生產是本研究的最終目的，現(xiàn)有近2 000 m2現(xiàn)代化的植物提取純化車間，包括超臨界二氧化碳萃取設備、連續(xù)逆流提取機組、陶瓷膜組件、超濾膜組件、三效和五效蒸發(fā)濃縮器、直徑為2.5 m的不銹鋼陣列層析柱、大型減壓噴霧干燥塔等，對花青素系列產品提取、純化數(shù)字智能規(guī)模化生產極具代表性。

在規(guī)模化生產過程中，由于中試過程中沒有中試可用的超臨界二氧化碳設備，所以在生產車間前期還針對超臨界二氧化碳萃取工藝進行摸索和研究，結果表明規(guī)模化生產過程中的所得結果與小試重現(xiàn)性非常好，可以將小試數(shù)據(jù)為依據(jù)在超臨界萃取環(huán)節(jié)直接進行規(guī)模化生產。

同時發(fā)現(xiàn)，在規(guī)模化生產過程中，連續(xù)逆流提取技術相比中試和小試的回流提取具有極大的優(yōu)勢，其提取溫度可以降低，提取溶劑也可以大大減少，提取時間也更短，該步驟的生產效率大大提高且連續(xù)化程度極高，非常適宜規(guī)模化生產。針對連續(xù)逆流提取工藝，在前面中試的基礎之上，也在車間單獨進行工藝摸索和優(yōu)化，從而得到最貼合實際生產的工藝參數(shù)。

在生產過程中對溫度的調節(jié)始終是放在第一位，所以在各個加熱環(huán)節(jié)都針對性地加裝高精密的控溫裝置，隨時監(jiān)控和調節(jié)液體的溫度，確保花青素產品不因溫度過高而發(fā)生降解，確保最終產品合格。同時在各個主要環(huán)節(jié)安裝了在線pH計，隨時監(jiān)控液體的pH值。

區(qū)別于中試和小試，在規(guī)模化生產過程中也發(fā)現(xiàn)，其連續(xù)化程度要求高，直接導致生產過程中出現(xiàn)各種銜接不暢的問題，經常發(fā)生某個工序處于待料狀態(tài)或某個工序出現(xiàn)積料狀態(tài)，這都給生產人員帶來了極大的不便，其主要體現(xiàn)在濃縮工序和層析工序太慢，而其他工序則相對過快，在反復研究和工序調整下，通過調整投料速度，合理安排班組，最終連續(xù)化生產的問題得以有效解決。

確定各工序組合最優(yōu)工藝參數(shù)，擬定規(guī)模生產工藝路線，根據(jù)最終生產工藝自主研發(fā)制備相匹配的生產設備，購置和改造規(guī)模生產設備，完成規(guī)模生產線建設，實現(xiàn)規(guī)模化生產。

3.2 規(guī)模生產最優(yōu)工藝參數(shù)的確定

本研究在超臨界萃取脫脂除雜、膜分離技術除雜技術及大孔吸附樹脂純化工藝的小試研究基礎上進行高純度花青素的中試研究和規(guī)模化生產，并充分結合生產實際進行參數(shù)調整后，確定規(guī)模化生產工藝最優(yōu)參數(shù)如下。

（1）超臨界CO2萃取除雜的工藝參數(shù)：壓力為30 MPa、溫度為50 ℃、流量為40 L/h及其夾帶劑乙醇添加量為4%。

（2）連續(xù)逆流提取的工藝參數(shù)：料液比為1∶5、溫度為50 ℃、時間為55 min、流速為0.8 t/h。

（3）膜分離技術除雜的工藝參數(shù)：膜截留分子量為140萬Da、膜過濾溫度為60 ℃、壓力為0.6 MPa。

（4）大孔吸附樹脂層析純化工藝：高徑比為1∶5、洗脫劑的配比濃度為60%、上柱液pH值為4.0、上柱流速為1.0 BV/h。

4 結語

4.1 研究發(fā)現(xiàn)

（1）本研究自主研發(fā)的“超臨界萃取+膜分離技術”高效除雜技術，大大改善了由于物料前處理不充分，物料各種雜質含量過高而導致的大孔吸附樹脂層析過程中的易堵柱子、吸附性能差、吸附率低及產品含量低的問題，同時拓展了超臨界萃取技術的應用范圍，給行業(yè)內除雜技術提供了新思路。

（2）連續(xù)逆流提取技術在花青素生產中的應用，相比傳統(tǒng)的罐式提取技術，它操作簡單、連續(xù)性強、溶劑使用量少、提取率高，同時其能耗低，它有罐式提取無可比擬的先進提取技術，在植提技術中，具有極強的推廣和示范作用。本研究使用連續(xù)逆流提取技術，迎合了花青素由于不穩(wěn)定而導致提取過程必須相對低溫、短時間和少溶劑的苛刻要求，在實際生產中取得了極好的效果。

（3）本研究開發(fā)了大孔樹脂層析純化方式，該工藝比較常用，采用梯度洗脫可以得到不同規(guī)格產品，并在本研究中得到了較好的效果。

4.2 經驗和建議

超臨界CO2裝置的設計壓力一般都在30 MPa以上，對周邊環(huán)境及人員安全防護要求較高。在研究超臨界CO2萃取技術的同時，可以考慮新開發(fā)多級大孔樹脂聯(lián)用技術，采用多級連續(xù)上柱與單級洗脫相結合的方式，同樣可以取得很好的純化效果，并且該技術對設備要求不高，運行成本也更低。

此外，超臨界設備屬于管制壓力容器設備，安監(jiān)部門對安裝和使用有著非常嚴格的要求，一般不適宜安裝在高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)，限制了這種高端設備的使用。一般可將這些設備安裝在適宜安裝的地點及相應的公司，報備安監(jiān)部門，實行遠程管理，動態(tài)使用，將需要用到超臨界的工藝步驟在公司以外的地方處理，既可實現(xiàn)保證技術又保證效果的最佳狀態(tài)。

參 考 文 獻

[1]廖禹東，郭忠.洛神中花青素含量分析及體外抗氧化實驗研究[J].農家參謀，2020（21）：73-74.

[2]卓毓光，劉儒華，古福生，等.花青素穩(wěn)定性影響因素與應用研究進展[J].廣東化工，2018，45（24）：70-72.

[3]宋丹，靚敏，雷虹.植物中花青素研究現(xiàn)狀[J].食品安全導刊，2018（36）：133.

[4]王超雪，陳瑞戰(zhàn)，陸娟，等.黑枸杞花青素不同提取工藝及抗氧化活性[J].食品工業(yè)，2020，41（6）：24-28.

[5]趙軍.大孔樹脂分離純化迷迭香中齊墩果酸的研究[J].企業(yè)科技與發(fā)展，2020（4）：37-38，41.