不同細胞來源外泌體在骨質疏松小鼠體內的骨靶向性比較

顧 亞，李 毅，陳 銘，尹鵬濱，張里程，唐佩福解放軍醫學院，北京 00853； 解放軍總醫院第一醫學中心 骨科，北京 00853

外泌體是一種天然的脂質體，在調控骨代謝過程中發揮重要作用。外泌體可以通過傳遞蛋白、核酸發揮細胞間通訊的作用。其還是一種比較理想的藥物載體，憑借歸巢能力，可被靶細胞特異性吸收。已有研究利用外泌體進行骨組織修復，治療骨折、骨缺損和骨質疏松等[1-4]。骨修復過程涉及骨微環境中的多種細胞，如樹突狀細胞、間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)、成骨細胞和內皮細胞等，這些細胞相互影響、相互調節，進而促使骨修復重建[5]。研究證明骨組織來源相關細胞分泌的外泌體中包含對骨重塑有重要作用的關鍵因子，如蛋白質、miRNA、各種活性因子等[6]。在骨組織工程中，越來越多的研究開始用外泌體代替MSC進行骨修復[7]。外泌體作用于靶向細胞的方式主要有三種：1)直接與靶細胞的胞膜融合，同時釋放mRNA、miRNA進入細胞質；2)通過內吞作用被靶細胞攝取；3)識別細胞表面的特異性受體[8]。不同細胞來源外泌體對骨組織的靶向性目前研究較少。本研究擬提取不同細胞來源的外泌體，通過在體、離體外泌體分布比較不同外泌體對骨組織的靶向性，篩選出具有高度骨靶向性的外泌體，為構建外泌體靶向遞送系統提供參考，以期為臨床治療提供新思路。

材料和方法

1 實驗動物 36只8周齡C57BL/6雌性小鼠(由解放軍總醫院國家二級動物實驗中心提供)，小鼠體質量(20±1) g，適應性飼養4周。動物實驗獲解放軍總醫院醫學倫理委員會批準(編號：HP2021-50-80403)，并按照《NIH實驗動物使用指南》(第4版，2008)進行。

2 細胞、試劑和藥品 DMEM培養液、α-MEM培養液、青霉素/鏈霉素雙抗液、胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶 (Sigma公司)；MSC、乳腺癌細胞(4T1)、成骨前體細胞(MC-3T3-E1)細胞株、腎上皮細胞(293T)細胞株(均由解放軍總醫院骨科研究所提供)；細胞外囊泡 (外泌體) 分離柱(Izon公司)；超濾管 (Millipore公司)；異氟烷(瑞沃德)；DiR熒光染料，DiD熒光染料(北京泛博生物化學有限公司)；外泌體洗脫柱(Invitrogen)；小動物活體成像系統(美國Kodak公司)。

3 細胞培養 1) MC-3T3-E1：將MC-3T3-E1細胞株復蘇后置于含10%無外泌體胎牛血清、青鏈霉素雙抗的α-MEM培養基；2) MSC、4T1和293T：細胞株復蘇后均置于含10%無外泌體胎牛血清、青鏈霉素雙抗的DMEM培養基；3)以上4種細胞均置于37℃、5% CO2環境進行培養，每48 h換液1次，每天觀察細胞生長情況，待細胞增殖到培養皿面積80%時可進行傳代。

4 外泌體提取 將收集的細胞上清液進行濃縮，4 000 g 4℃離心1 h，采用凝膠排阻法對濃縮后的上清液進行外泌體提取。收集提取后的外泌體于-80℃保存。

5 外泌體熒光染色 制備熒光標記外泌體需全程避光。將制備好的外泌體從-80℃冰箱取出，用DiR熒光染料以1∶100體積比加入外泌體，放入37℃搖床1 h，使其染色充分。利用外泌體洗脫柱，800 g室溫離心3 min，收集離心后液體，鋁箔紙包裹，避光保存。

6 骨質疏松模型制作及分組 待C57雌性小鼠到達12周齡后進行去卵巢手術，術后8周行micro-CT確認骨量降低，開始做小動物活體成像實驗，根據四種不同細胞來源外泌體將小鼠分為4組，每組9只小鼠，其中每組小鼠平均分為3小組，分別進行小鼠動態活體成像、解剖后股骨活體成像和股骨病理切片觀測。

7 在體觀察外泌體分布 將不同細胞來源外泌體通過尾靜脈分別注射至4組骨質疏松小鼠中，每組3只小鼠，在注入熒光外泌體后的1 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d，用小動物活體成像系統進行活體成像，觀測不同細胞來源外泌體在骨質疏松小鼠體內的分布。

8 離體觀察外泌體分布 活體觀察發現在第3天時小鼠下肢骨組織熒光聚集最明顯，于是重新用DiR染色外泌體，分別尾靜脈注射至4組骨質疏松小鼠體內，每組3只小鼠。待第3天處死小鼠，取小鼠心臟、肝、脾、肺、腎與雙下肢骨組織于10 cm2培養皿中，再次用活體成像機器進行圖像采集，用于比較各臟器內外泌體含量。

9 股骨病理觀察 大體觀察結束后，用DiD染色外泌體，分別尾靜脈注射至4組骨質疏松小鼠，每組3只。待第3天處死小鼠，將股骨標本置于100 g/L多聚甲醛4℃固定48 h后，放入10% EDTA液于4℃冰箱內脫鈣24 h。常規沉糖脫水、OCT包埋，沿股骨冠狀位進行切片，切取10 μm厚的病理切片，并利用DAPI染色，封片，觀察股骨內熒光外泌體分布。

10 統計學分析 統計學分析應用SPSS19.0軟件、GraphPad Prism 8軟件和Carestream MI SE完成，計量數據以表示，多組間比較采用方差分析(兩兩比較采用t檢驗)；計數資料以例數和百分比表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同來源外泌體骨靶向性在體觀察 從圖1中可以看出MSC來源外泌體、MC-3T3-E1來源外泌體均具有骨靶向性，能夠在骨質疏松嚴重的部位聚集且在第3天達到最高峰，隨時間延長熒光逐漸消失。293T和4T1來源外泌體在骨質疏松嚴重部位有微量熒光且不隨時間變化而改變，說明其隨著血液循環在骨組織處停留。提示MSC來源外泌體、MC-3T3-E1來源外泌體具有骨靶向性，而293T、4T1來源外泌體無骨靶向性。

圖1 不同細胞來源外泌體在體熒光動態觀察A：活體成像觀察注入熒光外泌體后的體內分布情況；B：熒光定量Fig.1 In vivo fluorescence dynamic observation of exosomes from different cell sourcesA: Observation of the distribution of fluorescent exosomes after injection by in vivo imaging; B: Fluorescence quantification

2 不同來源外泌體骨靶向性離體觀察 在外泌體骨聚集最強時間點解剖，進行不同器官的離體熒光成像。離體熒光成像顯示四種外泌體均在肝處聚集最強，說明外泌體代謝途徑為肝代謝。其中MSC來源外泌體骨靶向性最好，MC-3T3-E1來源外泌體骨靶向性次之。圖2B為骨組織絕對熒光強度分析，其中MSC來源外泌體熒光強度最強(P＜0.05)，293T與4T1無統計學差異。圖2C為骨組織占總體熒光強度的百分比，其結果與圖2B趨勢一致。

圖2 不同細胞來源外泌體離體熒光觀察(aP ＜ 0.01；bP ＜ 0.05；ns：not significant)A：熒光最強時間點各組織的分布情況；B：骨組織絕對熒光強度分析；C：骨組織占總體熒光強度的百分比Fig.2 In vitro fluorescence observation of exosomes from different cell sources (aP ＜ 0.01; bP ＜ 0.05; ns: not significant)A: The distribution of each tissue at the time point of the strongest fluorescence; B: Analysis of absolute fluorescence intensity of bone tissue; C: Percentage of bone tissue to overall fluorescence intensity

3 不同來源外泌體骨靶向性免疫熒光染色 股骨組織切片(圖3A)顯示不同來源外泌體均能夠通過血液進入骨組織，而進一步觀察骨小梁部位，MSC來源外泌體、MC-3T3-E1來源外泌體能夠顯著聚集在骨小梁周圍，293T、4T1來源外泌體在骨小梁聚集較少。骨組織病理切片熒光定量顯示，MSC來源外泌體骨組織內熒光強度最高，且與其他三組有統計學差異(P＜0.05)，見圖3B。

圖3 股骨組織切片觀察骨小梁部位不同細胞來源外泌體聚集情況(aP ＜ 0.01；ns：not significant)A：免疫熒光染色股骨組織切片觀察(黃色箭頭：外泌體)；B：熒光定量Fig.3 Femoral tissue section to observe the accumulation of exosomes from different cells in the trabecular bone (aP ＜ 0.01;ns: not significant)A: Observation of femoral tissue sections by immunofluorescence staining (yellow arrows: exosomes); B: Fluorescence quantification

討 論

近年來，外泌體在骨科疾病中的作用被人們廣泛關注，目前多種細胞來源外泌體已被證實參與骨代謝過程[9-10]。供體MSC來源的外泌體可通過轉運miR-26a恢復宿主MSC功能并緩解骨質疏松[11]。Cui等[12]研究發現，MC-3T3-E1分泌的外泌體能夠進一步促進成骨細胞的礦化，且miRNA表達譜發生顯著改變，進一步研究提示成骨前體細胞來源外泌體可能募集骨髓基質細胞進行成骨分化。Vracar等[13]研究發現抗腫瘤藥物依諾沙星能夠通過刺激4T1細胞分泌外泌體進而抑制破骨細胞形成。以上研究表明外泌體能夠廣泛參與骨調控，并能夠修復骨組織，促進骨再生。

既往研究表明干細胞來源外泌體具有良好的促組織修復能力，因此被廣泛用于多種類型的組織修復[14]。Qi等[15]研究發現人誘導的多能干細胞衍生的間充質干細胞可通過促進骨再生和血管產生進而促進大鼠臨界顱骨缺損的愈合。Furuta等[16]發現CD9-/-小鼠由于分泌外泌體量少，骨折愈合速度顯著低于野生型小鼠，而外源性給予間充質干細胞來源外泌體能夠加速骨折愈合，而Liu等[17]研究發現低氧狀態下的間充質干細胞能夠通過外泌體運輸miR-126促進骨折愈合。有研究表明間充質干細胞來源外泌體能夠激活MAPK通路進而改善骨質疏松癥狀。以上研究表明干細胞來源外泌體在促骨組織修復領域具有良好前景。

外泌體具有良好的生物活性，得益于外泌體表面的CD47，它能夠阻止外泌體在血液循環系統中被單核細胞清除，因此外泌體具有足夠時長的循環半衰期和免疫逃逸能力，且能夠加載多種不同的藥物[18]。目前已有多項研究通過對外泌體進行工程化改造進而治療骨科領域疾病。Song等[19]研究發現內皮細胞來源外泌體能夠顯著靶向骨組織，并能夠通過抑制破骨細胞活性進而改善骨質疏松癥狀。后續研究者通過對外泌體進行工程化改造以提高其靶向性和促再生能力，進而提升修復效果。Luo等[20]將間充質干細胞來源外泌體結合干細胞特異性適配體，進而增強其對骨髓間充質干細胞的親和力。研究顯示經過適配體修飾后的外泌體具有更好的促骨折愈合能力。以上研究提示我們不同來源的外泌體對骨組織靶向性有顯著差異，挑選合適來源的外泌體對構建促組織修復載體具有重要意義。

為進一步探索外泌體對骨的靶向性，本研究選取間充質干細胞來源外泌體、成骨前體細胞來源外泌體、腎上皮細胞來源外泌體、乳腺癌細胞來源外泌體進行探索。我們推測干細胞來源、骨細胞來源以及具有高骨轉移性腫瘤細胞來源的外泌體均可能具有骨靶向性，而腎上皮細胞系是研究中常用的惰性細胞系，可能不具有骨靶向性。本研究結果顯示干細胞、骨細胞來源的外泌體骨靶向性好，這與我們的預期一致。然而腫瘤細胞與腎上皮細胞細胞系來源外泌體均未觀察到骨靶向性。研究結果提示干細胞來源外泌體以及成骨前體細胞來源外泌體可能是構建骨靶向性載體的理想選擇。后續研究需進一步探索外泌體骨靶向性的分子機制，以期為構建骨組織藥物遞送載體提供新思路。