無創產前檢測適用人群的探討及其臨床應用評價

侯 偉，周紅輝，謝瀟瀟，李江華，姜淑芳，高志英，游艷琴

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第一醫學中心 婦產科，北京 100853

基于胎兒游離DNA(cell free DNA，cf-DNA)檢測的無創產前篩查(noninvasive prenatal test，NIPT)用于檢測胎兒常見的非整倍體及部分性染色體異常，敏感度：21-三體為0.994(0.983～0.998)，18-三體為0.977(0.952～0.989)，13-三體為0.906(0.823～0.958)；特異性均達到0.999以上，是目前最準確的產前篩查方法[1]。母體外周血中的胎兒cf-DNA主要來源于胎盤滋養層細胞，其遺傳成分并不總是與胎兒一致，因此NIPT無法替代侵入性產前診斷(羊水穿刺術或絨毛膜穿刺術)[2]。目前NIPT的適用人群為血清學篩查臨界風險、有侵入性產前診斷禁忌者以及錯過血清學篩查最佳時間者，高齡孕婦(預產期年齡 ≥ 35歲)為NIPT的慎用人群[3]。同時高齡也是侵入性產前診斷的指征，因此臨床上建議高齡孕婦可直接行侵入性產前診斷[4]。研究認為35～38歲孕婦的胎兒非整倍體發生率并無明顯上升，孕婦35歲時孕中期胎兒21-三體的患病率為4.0‰，38歲時為8.7‰，而42歲時為24.1‰；18-三體和13-三體的發病率在38歲后也明顯升高[5]。有學者因此提出，在NIPT日趨成熟的情況下，部分風險相對較低的高齡孕婦可行NIPT篩查，即37歲前可先行NIPT，篩查陽性者行侵入性產前診斷驗證，陰性者不再行產前診斷[6]。以往研究證實NIPT在高危孕婦中有著很高的敏感度和特異性[7]。本研究對接受侵入性產前診斷的孕婦進行NIPT，比較不同產前診斷指征與胎兒染色體異常的相關性，探討擴展NIPT的適用人群及臨床應用價值。

對象和方法

1 對象 選取2018年1月16日- 2020年6月30日，在解放軍總醫院第一醫學中心就診的孕婦。納入標準：1)年齡 ≥ 18歲；2)單胎妊娠；3)在解放軍總醫院第一醫學中心行侵入性產前診斷，侵入性產前診斷的臨床指征主要有預產期年齡 ≥35歲、血清學篩查高風險或灰區、NIPT結果異常、胎兒超聲結構異?；蜍浿笜水惓?、不良妊娠史或遺傳學家族病史(自身為患者或攜帶者、生育過遺傳病患兒或家族中有遺傳病患者)；4)經過咨詢并簽署知情同意書。排除標準：1)妊娠合并惡性腫瘤；2) 1年內接受過異體輸血、移植手術、異體細胞治療。本研究獲得解放軍總醫院醫學倫理委員會批準。

2 檢測方法 1) NIPT：本研究入組孕婦均行NIPT，在侵入性產前診斷前兩周內進行。每名入組孕婦采集8 mL外周血于cfDNA采血管 (Streck,USA)，分離血漿后使用DNeasy Blood Kit (Qiagen)提取基DNA，基因組DNA打斷成小片段 (Covaris，S220，USA)，并使用KAPA Hyper Prep Kit (KAPA，KK8504，USA)構建文庫。高通量測序在Nextseq CN500平臺(Illumina，San Diego，CA)進行，以檢測染色體非整倍體的情況。NIPT的結果表示為胎兒染色體異常高風險或低風險；若胎兒游離DNA濃度小于4%，NIPT無結果(no call)。2) 侵入性產前診斷：獲得的羊水細胞或絨毛膜細胞行核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)或染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)。

3 危險因素分析及計算公式 采用多因素logistic回歸分析，比較不同產前診斷指征與胎兒染色體異常的關系。NIPT的篩查方案：低風險者不再行侵入性產前診斷，高風險或無結果需行進一步產前診斷。當不同高危因素的孕婦應用該NIPT篩查方案后，計算侵入性產前診斷的需求量、異常檢出率及NIPT的陰性預測值。計算公式如下：

侵入性產前診斷的需求量=入組孕婦總數-NIPT低風險數斷，高風險或無結果需行進一步產前診斷。當不同高危因素的孕婦應用該NIPT篩查方案后，計算侵入性產前診斷的需求量、異常檢出率及NIPT的陰性預測值。計算公式如下：

產前診斷的異常檢出量=胎兒異常總數-NIPT為低風險的胎兒異常數斷，高風險或無結果需行進一步產前診斷。當不同高危因素的孕婦應用該NIPT篩查方案后，計算侵入性產前診斷的需求量、異常檢出率及NIPT的陰性預測值。計算公式如下：

產前診斷的陽性率=產前診斷的異常檢出量/產前診斷的需求量

NIPT的陰性預測值=(NIPT低風險數-NIPT為低風險的胎兒異常數)/NIPT低風險數

4 統計學方法 統計分析使用SPSS22.0軟件進行。計量資料以表示，計數資料以例數(百分比)表示，多因素分析采用logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 孕婦一般情況及產前診斷信息 總計有1 261例孕婦納入本研究，平均年齡(34.65±5.02)歲，行產前診斷時的平均孕周為(20.18±1.73)周，侵入性產前診斷的臨床指征及檢測項目見表1。

表1 1 261例孕婦的臨床指征及產前診斷Tab.1 Clinical indications and methods of prenatal diagnosis in 1 261 pregnant women

2 侵入性產前診斷與NIPT結果比較 侵入性產前診斷檢出胎兒染色體異常87例，異常檢出率為6.90%，包括21-三體35例，18-三體6例，13-三體1例，性染色體非整倍體12例，胎兒嵌合體9例，微缺失重復22例，雜合性缺失1例，單親二倍體1例。NIPT高風險或無結果82例，低風險 1179例。對于上述胎兒染色體異常，NIPT整體的特異性為97.61%(1 146/1 174)，陰性預測值為97.20%(1 146/1 179)，診斷符合率為95.16%(1 200/1 261)(表2)。NIPT低風險但產前診斷證實胎兒異常33例，其中32例來源于NIPT檢測范圍之外的染色體異常，包括胎兒微缺失重復22例、胎兒嵌合體7例、雜合性缺失1例、單親二倍體1例、等臂雙著絲粒Y染色體1例(表3)。

表2 1 261例孕婦的NIPT及產前診斷結果(n, %)Tab.2 Results of NIPT and prenatal diagnosis of 1 261 pregnant women (n, %)

表3 產前診斷結果為異常而NIPT為低風險的33例孕婦信息Tab.3 Inconsistency between NIPT and invasive prenatal diagnosis in 33 cases

3 胎兒染色體異常的相關性分析 以胎兒是否存在染色體異常作為因變量，在接受侵入性產前診斷的孕婦中比較不同產前診斷指征與胎兒染色體異常的相關性。多因素logistic全?；貧w分析顯示：在這一人群中，高齡(OR=0.470，P=0.010)和超聲異常(OR=2.939，P＜0.001)與胎兒染色體異常的相關性有統計學意義，而血清學篩查異常(OR=0.075)和不良孕產史及家族史(OR=0.492)無統計學意義(表4)。臨床意義：在接受侵入性產前診斷的孕婦中，單純高齡孕婦的胎兒染色體異常風險低于這一人群的平均風險，而超聲異常的孕婦高于這一人群的平均風險。

表4 胎兒染色體異常的多因素logistic回歸分析(n, %)Tab.4 Multivariate logistic regression analysis of factors related to fetal chromosome abnormalities (n, %)

4 單純高齡孕婦應用NIPT對產前診斷的影響 1 261例孕婦的胎兒異常檢出率為6.90%。本研究中高齡孕婦占55.51%(700/1 261)，其中高齡為唯一危險因素的孕婦占44.09%(556/1 261)。38歲以下的單純高齡孕婦應用NIPT時，產前診斷的需求數量減少16.34%(217/1 261)，產前診斷的陽性率為7.87%。42歲以下的單純高齡孕婦應用NIPT時，產前診斷的需求數量減少35.77%(472/1 261)，產前診斷的陽性率為10.00%。所有單純高齡孕婦應用NIPT時，產前診斷需求量下降42.19%(532/1 261)，產前診斷陽性率達11.11%，陰性預測值為98.92%(圖1)。單純高齡孕婦中共發現6例胎兒染色體異常而NIPT為低風險，其中1例為性染色體嵌合 [X0(26%)/XY(74%)]，1例為10號染色體單親二倍體，4例為微缺失重復(缺失/重復片段大小1.2～2.4 Mb)，均在NIPT檢測范圍外。

圖1 改變NIPT的年齡限制對產前診斷的需求量及陽性率的影響Fig.1 Effects of changing age limits for NIPT on demand for prenatal diagnosis and positive rate

5 其他單一高危因素的孕婦應用NIPT對產前診斷的影響 唯一危險因素為超聲異常的孕婦占6.66%(84/1 281)，應用NIPT可減少6.58%(83/1 261)的產前診斷，陰性預測值91.57%(76/83)；血清學篩查異常為唯一危險因素的孕婦占19.19%(242/1 261)，應用NIPT可減少18.87%(238/1 261)的產前診斷，陰性預測值98.32%(234/238)；不良孕史或家族史為唯一危險因素的孕婦占9.60%(121/1 261)，應用NIPT可減少9.60%(121/1 261)的產前診斷，陰性預測值97.52%(118/121)。不同危險因素的孕婦應用NIPT篩查后產前診斷的陽性率：血清學篩查異常為8.11%，超聲異常為6.79%，不良孕史或家族史為7.37%(表5)。

表5 單一高危因素孕婦應用NIPT對產前診斷的影響Tab.5 Effect of NIPT on need of prenatal diagnosis in pregnant women with a single risk factor

討 論

隨著我國二胎政策的開放以及生育觀念的改變，產前診斷的服務量逐年提高，并且2013年以后高齡成為產前診斷的最主要指征[8]。與此同時，NIPT在近十年發展迅速，2020年美國婦產科醫師學會提出：無論年齡或其他風險因素如何，均建議對所有孕婦進行無創產前檢測[9]。NIPT屬于一項篩查技術而非診斷技術，其結果存在一定的不確定性。NIPT假陽性的原因包括局限性胎盤嵌合體、孕婦本身為染色體非整倍體、母源性的拷貝數變異、母源性惡性腫瘤、雙胎之一胎死宮內等；假陰性的原因包括胎兒濃度較低、胎盤低比例嵌合、胎兒嵌合但胎盤正常等[10]。目前各專業結構推薦的NIPT檢測范圍包括211813號染色體以及部分性染色體的異常，尚不推薦將檢測范圍擴展至微缺失重復以及其他染色體異常[11-12]。因此，能否通過擴展NIPT適用人群來減少產前診斷值得討論。

本研究主要探討擴展NIPT的適用人群及應用評價。胎兒非整倍體風險隨孕婦年齡增大而升高，35歲孕婦胎兒非整倍體風險與產前診斷導致的流產風險大致相當(約1/200)，據此大多數國家的醫療機構對35歲及以上的孕婦提供產前診斷[13]。孕婦年齡作為篩查的敏感度和陽性預測值低，高齡作為產前診斷指征受到越來越多的質疑[6]。本研究中高齡與胎兒染色體異常的相關性低于其他產前診斷指征，因此在高危孕婦中優先選擇高齡孕婦應用NIPT。在單純高齡孕婦中，依據年齡逐步擴展NIPT的應用范圍，產前診斷的需求量下降達42.19%，產前診斷發現胎兒異常比例由6.90%升至11.11%，提高了產前診斷的效率，同時陰性預測值達98.92%。因此單純高齡孕婦可行NIPT，根據篩查結果決定是否行侵入性產前診斷。

超聲異常包括胎兒結構異常和軟指標異常，這些異常很有可能與某個遺傳綜合征或遺傳缺陷疾病相關。導致超聲異常的遺傳學因素很多，相當一部分超出了NIPT的檢測范圍，如染色體拷貝數異常(copy number variation，CNV)、胎兒嵌合體等，僅行NIPT無法除外這些遺傳學異常。Wapner等[14]研究發現超聲提示結構異常但核型分析正常的胎兒，可額外檢出6.7%的CNV，高于高齡孕婦(1.6%)，提示胎兒結構異常與CNV之間存在相關性[14]。本研究中，當孕婦合并超聲異常時NIPT漏診風險明顯升高，NIPT陰性預測值僅為91.57%。因此對于超聲提示胎兒結構異常的孕婦，不建議行NIPT篩查，仍需侵入性產前診斷。

除了擴展適用人群之外，擴展NIPT的檢測范圍同樣意義重大。理論上基于全基因組測序的NIPT可以發現胎兒的染色體拷貝數異常，即NIPT-plus。NIPT通常采用低深度測序，增加測序的深度可以提高檢出胎兒CNV的能力，同時減少假陽性率[15]。并不是所有的CNV都適合進行篩查，需要考慮到CNV的大小、外顯率、表型、發病率等因素。CNV越小，需要的測序深度及成本越高；CNV越大，包含的基因越多，致病的可能性越高。目前已有商業化的NIPT涵蓋表型明確、外顯率高、發病率相對較高的CNV，如DiGeorge Syndrome (DGS)、1p36 Deletion、16p12.2-p11.2 Syndrome、Angelman/Prader-Willi Syndrome、Cridu-chat Syndrome等[16]。與非整倍體不同，胎兒CNV的發病率與孕婦年齡無關[17]。本研究共檢出22例微缺失重復，其中5例在NIPT中有相應發現，敏感度為27.3%(6/22)。還有部分NIPT發現的微缺失重復缺乏CMA檢測及臨床驗證，本研究尚無法計算NIPT對于微缺失重復的陽性預測值，待完善新生兒隨訪作為臨床驗證，可計算NIPT檢出胎兒微缺失重復的陽性預測值及特異度。目前還需要大規模的隊列研究證實NIPT-plus效能，作為臨床常規應用的方案尚不成熟[18-19]。

綜上所述，在NIPT應用日趨完善的今天，高齡孕婦在排除其他產前診斷指征之后可以選擇NIPT進行篩查，出現陽性結果時再行產前診斷，從而避免有創操作帶來的流產風險。將NIPT的適用人群擴展至單純高齡孕婦可以顯著減少產前診斷數量，并提高產前診斷的效率。對于合并超聲異常、血清學篩查異常、不良孕史或遺傳學家族史的孕婦，選擇NIPT將承擔更大的漏診風險，并且漏診風險主要來源NIPT檢測范圍之外的染色體異常，如胎兒嵌合體、微缺失重復等。因此要嚴格把握NIPT適用指征，合并高齡以外產前診斷指征的孕婦仍需行侵入性產前診斷。