菌落PCR 在高中生物學實驗中的應用*

章熙東 （南京外國語學校 江蘇南京 210008）

多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，簡稱PCR）是一種快速、特異性擴增某特定片段DNA 的分子生物學技術，在生命科學研究中有廣泛的應用，尤其在2020 年新型冠狀病毒檢測中以“快速、準確、高效”的篩選出新型冠狀肺炎患者突顯PCR 的技術魅力[1]。在高中生物學教學中，PCR 屬于選擇性必修模塊3《生物技術與工程》中“基因工程”教學的一部分，可用于“提取目的基因和擴增目的基因”，其理論基礎涉及必修2《遺傳與進化》“DNA 結構與復制”等內容。《普通高中生物學課程標準（2017 年版）》明確指出，在幫助學生達成“基因工程賦予生物新的遺傳特性”大概念的理解時，應通過開展“PCR 擴增DNA 片段并完成電泳鑒定”，促進學生生物學學科核心素養的提升。因此，高中階段開展PCR 實驗，利于培養學生結構與功能觀、物質與能量觀等生命觀念，利于學生在設計實驗、操作實驗中提升科學思維品質和科學探究能力，利于在對新冠肺炎疫情等社會熱點議題討論中培養社會責任。但在實際教學中，由于儀器的缺乏，PCR 技術的教學還是浮于紙面。即使有PCR儀，由于實驗成本較高，操作過程復雜，實驗時間長，往往僅讓學生參觀儀器，而讓PCR 儀成為擺設。“重理論，輕實踐；重解題，輕技術”的現象沒有得到改變。因此，將菌落PCR 引入高中課堂，能降低成本、縮短時間，讓PCR 實驗真正走入高中課堂，讓學生親歷實驗過程，掌握PCR 技術，發展生物學學科核心素養。

基于真實情境下的問題解決能力的培養更利于培養學生的創新精神，因此，面對“土壤磷元素缺乏，影響農業生產”的世界性問題，提高土壤中有效磷元素的含量是科學家迫切想要解決的問題之一。土壤中難溶性磷的轉化依賴于一類解磷菌的微生物[2]（主要為細菌），因此，通過項目式學習，帶領學生分離純化并鑒定土壤中的解磷菌，具有重要的社會意義。同時，讓學生在問題解決中習得知識，掌握技術，培養能力，是新課程理念所倡導的教學方式。

1 菌落PCR

菌落PCR（colony PCR）可不必提取目的基因DNA，不必酶切鑒定，直接以菌體熱解后暴露的DNA 為模板進行PCR 擴增，省時省力，常應用于快速鑒定菌落是否為含目的基因的陽性菌落。與普通DNA 的PCR 相比，菌落易獲得，少了提取目的基因步驟而省時，也因不必購買目的基因，一般中學實驗室就可操作。而且，可與“微生物的分離與培養”實驗專題相銜接，教學設計時可作為1 個單元的整體化設計。

2 實驗過程及結果

2.1 菌落獲得 本實驗采用的菌落為在“微生物的分離與培養”實驗中，校園“尋找高效解磷菌，緩解土壤缺磷”的項目式學習的學生從校園土壤中所分離出的解磷菌菌落[3]。挑選了解磷圈較大較明顯的菌落（圖1），用于PCR 和菌種鑒定。

圖1 出現解磷圈的菌落

2.2 菌落PCR

1）制備菌懸液：用高壓蒸汽滅菌過的無菌牙簽挑取解磷菌的單個菌落，置于20μL ddH2O 中攪拌，將裝有20μL ddH2O 的PCR 管在100 ℃下煮2 min，冷卻后成為菌懸液。

2）設計引物：采用細菌16S rRNA 基因通用引物進行菌落PCR，引物序列為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

3）擴增體系：擴增體系20 μL，Fast PCR Master Mix 體系（TaKaRa）10μL，引物27F 與引物1492R 各1μL，菌懸液1μL，ddH2O 7μL（菌懸液與ddH2O 加入量視菌懸液濃度及時調整）。

4）菌落PCR 反應條件設定：94℃預變性1 min；98℃變性5 s，55℃退火5s，72℃延伸20 s，變性退火延伸共30 個循環；循環結束后，72℃保溫10 min（使延伸更充分）（圖2）；4 ℃保存。

圖2 PCR 參數設置

5）PCR儀器擴增。Bio-Rad PCR儀T100，96孔。

2.3 凝膠電泳 電泳是指帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。DNA 分子帶有負電，在電場的作用下，DNA 分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。利用DNA 樣品分子本身的大小，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現不同大小DNA 分子的分離。瓊脂糖凝膠電泳技術可用于對PCR 擴增成功與否進行鑒定，從而為后續的基因測序提供保證。

1）制膠：PCR 擴增期間，配制1%瓊脂糖凝膠。稱取1 g 瓊脂糖加入至100 mL 1×TAE 緩沖液中，微波加熱溶解；溶解后加入GelRed 核酸染料，倒入制膠板中，置于室溫下待凝固（約20 min）。

2）點樣：取5 μL 擴增產物與上樣緩沖液混合，將混合液點樣至1%瓊脂糖凝膠中。

3）電泳：120 V 電壓下電泳15 min。

4）觀察：將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統進行PCR 產物檢測，確認條帶并拍照（圖3）。將剩余PCR 產物送至測序公司進行測序。

2.4 實驗結果 電泳結果顯示，所有菌落擴增后在1 465 bp 處均出現單一條帶（圖3），說明在所取菌落中都能擴增出作為細菌身份的16S rRNA 基因，后續選擇清晰明顯條帶所對應的PCR 產物送至基因公司進行測序，根據結果構建系統發育樹，確定所分離出的菌落各屬于何種細菌。

圖3 菌落PCR 電泳圖

3 實驗時間分配

本實驗利用連續2 節課的時間（約80 min），完成PCR 和電泳實驗。具體時間分配見表1。實驗操作約55 min，其他時間用于理論指導、結果觀察、課堂小結等。

表1 時間安排

4 教學反思

4.1 重時間有效管理，助實驗有序進行 利用儀器進行PCR 的時間進行制膠。在儀器配置上，PCR 儀選擇96 孔為宜，且較好品牌儀器升、降溫速度較快，節約實驗時間。選用生物公司專門用于進行菌落PCR 的試劑盒（Fast PCR Master Mix），其包含的Taq 酶高效（延伸速度為10 s/kb），可縮短PCR 中各階段的反應時間，在30 min 內完成PCR 擴增，與普通PCR 相比，所用時間縮短一半。制膠板選擇雙排，一排25 孔，總共可上50 個樣，保證讓每個學生能進行點樣操作。優化后的實驗，能在55 min 內完成PCR 和電泳實驗。

4.2 重關鍵能力培養，促學科素養提升 在進行菌落PCR 的實驗中，培養學生的分子生物學中的關鍵能力，符合“教學過程重實踐”的新課程理念。在PCR 教學中，不只追求學會操作儀器，更應注重學生思維品質的提升，引發學生對“為什么要進行PCR、如何進行PCR、如何解讀PCR 結果”等問題的深度思考。

1）為什么要進行PCR？在本實驗中，基于“分離出高效解磷菌以解決土壤有效磷含量低”的現實問題情境，通過技術手段分離出高效解磷菌形成菌落后，需對其進行種屬的分子鑒定以確定其系統發育地位，勢必要對解磷菌的DNA 進行測序。由于Sanger 測序需要足夠濃度的DNA，因此，在測序前會先進行PCR 擴增目的基因。如果只需要做定性檢測，菌落PCR 能得到與常規PCR 相同的結果，且可節省大量的人力、物力和財力，因此，本實驗選用菌落PCR。

2）如何進行PCR？PCR 過程由PCR 儀器完成，難點在于需實驗者構建PCR 反應體系。例如，模板的選擇、引物的設計、溫度的控制等，都是技術要點。

模板的選擇：在本實驗中，細菌主要存在3 種核糖體RNA（5S、16S、23S rRNA），因16S rRNA 基因有一段高度保守的序列，并且中間的高變區序列是每種細菌獨一無二的標記，因而設計引物擴增16S rRNA 基因這一段高度保守的序列。即“16S rRNA 基因”相當于細菌的“身份證”，必須先拿到身份證才能進行進一步的鑒別，所以應先將其擴增再進行序列的比對。

引物的設計：PCR 的成功與否與引物的選擇有關，設計引物的能力體現學生掌握PCR 的技術素養。針對引物的設計，如果所要擴增的目的基因在文獻中沒有報道研究，則需要研究者利用引物設計網站自行設計引物，常用的引物設計網站有Primer blast、Primer Premier 5.0、Primer 3 Plus 等。如果該目的基因在文獻中已有報道研究，則可從文獻查到該目的基因成熟的引物序列。本研究中學生通過查找閱讀大量文獻，選擇16S rRNA 基因的通用引物[4]。

體系的構建：反應體系的量根據需求而定。本實驗選用20 μL 的總反應體系，使用商品化的Fast PCR Master Mix（其中包含Taq 酶、dNTP 和緩沖液），其用量及PCR 儀器參數的設置參照說明書；在20 μL 的總反應體系中加入上、下游引物各1 μL；本實驗中加入1 μL 菌液作為模板。

3）PCR 電泳結果的解讀：PCR 擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠上點樣已知條帶大小的標準樣（DNA Marker），方便比對擴增產物的分子量大小。根據瓊脂糖凝膠電泳的結果選擇條帶較亮（產物較多）的樣品送去測序。最終將測序結果與Genebank 數據庫中序列進行比對，確定菌種的系統發育位置。

以實踐活動為學習起點，以問題解決為終點，學生從學習實驗原理，到進行實驗操作，感受解決問題的快樂，從中提升綜合能力。