二羥基丙酮還原糖屬性的實驗確認?

段雙庚 盧 彥 李 俊 丁 智 楊榮武?

（1 江蘇省大港中學 江蘇鎮江 212028 2 南京大學生命科學學院 江蘇南京 210023）

生物化學課程主要是學習生物體內各種組分，例如，糖類、脂類、蛋白質、核酸等生物分子的結構和功能。由于糖類化合物的結構和功能相對簡單，概念性定義較多，內容易教易學，并且與有機化學課程有部分重疊，因此，一些教師不重視糖類生物化學。近年，人們逐漸認識到糖類除了作為能源物質，還具有其他一些重要的生物學功能，例如，參與分子識別等。目前，糖鏈的研究已被公認為是繼蛋白質和核酸的研究后，探索生命奧秘的第3 個里程碑[1]。近期，斯坦福大學的科學家在哺乳動物體內，發現寡糖鏈可與非編碼RNA 共價結合在一起形成糖RNA（glycoRNA），且這種帶有糖衣的RNA 可定位在細胞表面[2]。由此可見，糖類這一章講解應是生物化學教師的必備技能。本文對糖的還原性進行深度思考，并設計實驗確認酮糖的還原糖屬性。

1 糖的還原性和還原糖

據調查，部分學生對還原糖的概念存在錯誤理解，他們認為：還原糖就是具有還原性的糖。這點比較容易糾正，具有高中化學知識的學生，只要記住糖的基本結構定義，即多羥基醛，或是的聚合物或衍生物，便能很快認識到還原糖和還原性之間無法畫等號。還原性是指在化學反應中被氧化的物質失去電子的能力。一種物質失電子能力越強，其還原性就越強；反之，物質失電子能力越弱，其還原性就越弱。物質的還原性是相對的，需要有參照物，這里的參照物就是配套的氧化劑是強還是弱。因此，不能簡單地將一種糖類化合物概括為具有還原性或不具有還原性。

還原糖的定義是什么？經查閱生物化學經典教材，將有關還原糖定義和說明內容，分別摘錄在表1 中。比較表1 中幾種還原糖的定義，不難發現，還原糖都與斐林試劑（Fehling's solution）這種弱氧化劑有關，即能被弱氧化劑（例如，Cu2+和Ag+）氧化或能將弱氧化劑還原的糖。其中，斐林試劑是一種可鑒別還原性物質的試劑，一般由氫氧化鈉與硫酸銅溶液配制而成，由德國化學家赫爾曼·馮·斐林在1849 年發明。Fehling 試劑常用于鑒定可溶性還原性糖，可與還原性糖反應生成磚紅色沉淀。此處強調弱氧化劑非常關鍵，若是包括強氧化劑（例如，硝酸），則所有的糖類化合物都是還原性的。朱圣庚等［4］在《生物化學》上冊給出的定義是“能使Fehling 試劑還原的糖，稱為還原糖”。該教材明確了還原糖的參照物其實是二價的銅離子。而在楊榮武等［3］的《生物化學原理》一書中，明確指出“能被弱氧化劑氧化的糖才是還原性糖”，并總結出“所有的單糖都是還原糖，所有的多糖都不是還原糖，而寡糖有的有、有的沒有”的結論，該結論是清晰明確還是略顯草率？

表1 經典教材中還原糖的定義

2 單糖還原性的爭議

雖然大多數大學生物化學教材對于還原糖的定義非常明確，但在網絡上仍有許多爭議。其中有部分是對還原性與還原糖的概念模糊造成的。此外，最簡單的酮糖，即1，3-二羥基丙酮（以下稱二羥基丙酮），是否屬于還原糖也令人困惑（圖1A和B）。在高中教輔書（圖1D）中特別指出：二羥基丙酮是非還原糖。在百度百科的詞條上（圖1C），二羥基丙酮也被標記了非還原糖屬性。還有一些文獻也提出了二羥基丙酮是非還原糖的觀點，但并沒有給出令人信服的理由[6-7]。筆者推斷：這可能是由于“所有的醛糖都是還原糖”已是共識，但酮糖的還原糖屬性在大部分的教材中并未明確提及。從圖1 總結，這些討論都傾向于認為：二羥基丙酮屬于非還原糖。

圖1 二羥基丙酮還原糖屬性的爭議

在體外，由于單糖中的醛糖與2-酮糖可在稀堿溶液中通過烯二醇中間物實現互變，在細胞內，則有專門的異構酶——磷酸丙糖異構酶催化磷酸化的甘油醛（3-磷酸甘油醛）和磷酸化的二羥基丙酮（磷酸二羥丙酮）相互轉變，而Fehling 試劑中含有稀堿溶液，故堅持二羥基丙酮是還原糖觀點的人認為：既然果糖（六碳酮糖）是還原糖，則二羥基丙酮（三碳酮糖）也應屬于還原糖。持反對意見的理由是：二羥基丙酮的2 號位為羰基不易被氧化，1 號位羥基氧化成為羰基，則導致1，2 號位置電子云密度過大，負電荷過于集中，產物不穩定。以上特性造成二羥基丙酮不易被氧化，即不具有明顯的還原性。

3 二羥基丙酮的還原糖屬性實驗

以上正、反觀點都有一定道理，是否有實驗驗證二羥基丙酮為還原性糖？筆者未查到利用實驗直接確定二羥基丙酮是否為還原糖的文獻。為此，從上海拓旸生物科技有限公司購買了5 g二羥基丙酮，設計并完成以下實驗，用以確認二羥基丙酮的還原糖屬性。

常見的還原糖定性實驗主要是采用Fehling試劑和本尼迪特（Benedict）試劑，其中，本尼迪特試劑，也稱班氏試劑、本尼迪克試劑、本尼迪克試液或班乃德試劑，是一種淺藍色化學試劑，為Fehling 試劑的改良試劑。考慮到Fehling 試劑的常用性，決定使用Fehling 試劑驗證實驗。

3.1 實驗器材及實驗試劑

1）試管（10 支）。

2）微量加樣器（1 mL）。

3）沸水浴裝置。

4）Fehling 試劑A：稱取硫酸銅（CuSO4·H2O）3.45 g，溶于蒸餾水并稀釋至50 mL。

5）Fehling 試劑B：稱取氫氧化鈉12.5 g，酒石酸鉀鈉13.7 g，溶于蒸餾水并稀釋至50 mL。

6）2%淀粉溶液：稱取0.2 g 淀粉定容在10 mL熱的蒸餾水中。

7）2%蔗糖溶液：稱取0.2 g 蔗糖定容在10 mL蒸餾水中。

8）2%葡萄糖溶液：稱取0.2 g 葡萄糖定容在10 mL 蒸餾水中。

9）2%二羥基丙酮溶液：稱取0.2 g 二羥基丙酮定容在10 mL 蒸餾水中。

3.2 實驗操作 各取20 mL Fehling 試劑A 和B，混合于燒杯中，即為Fehling 試劑，即混即用。取8只試管，洗凈烘干，按表2 操作。

表2 二羥基丙酮還原糖鑒定實驗

3.3 實驗結果 實驗顯色結果如圖2（見插頁2）， 描述性結果如表3。

表3 二羥基丙酮還原糖鑒定實驗現象與討論

3.4 實驗結論 二羥基丙酮為還原糖，其與Fehling 試劑可快速反應。

4 二羥基丙酮的還原糖屬性實驗的反思

根據實驗結果，筆者認為二羥基丙酮與Fehling 試劑能反應的原因是（圖3）：其2 號位的羰基在堿性條件下生成非常活潑的烯二醇結構，1 號位羰基再與二價銅離子發生氧化還原反應，羰基被氧化成為羧基，二價銅離子被還原成一價銅離子，生成氫氧化亞銅，加熱后變成氧化亞銅沉淀，溶液由藍色變成紅棕色，且有沉淀析出。而認為二羥基丙酮不是還原糖的觀點則只關注了其1 號位置上的羥基，認為該羥基無法被氧化成羰基，因此，沒有還原性。在確認二羥基丙酮屬于還原性糖后，從楊榮武主編的《生物化學原理》得出的“所有的單糖都是還原糖，所有的多糖都不是還原糖，而寡糖有的有、有的沒有［3］”的結論是完全成立的。

圖3 二羥基丙酮在堿性條件下通過烯二醇中間物與甘油醛的互變

糖的Fehling 實驗是經典還原糖實驗，目前也常用于產物為還原糖的化學反應的定性檢測，或鑒定某些催化上述反應的酶的活性，例如，乳糖酶活性檢測[8]。Fehling 實驗在部分高中生物學實驗中已開展，在大學生物化學實驗中也屬于重要的糖鑒定實驗。但實驗設計較為簡單，一般是對幾種經典的還原糖和非還原糖進行測定。筆者認為不妨將其升級，以問題為導向，在講解完畢糖的化學性質和經典化學反應后，向學生提出：“二羥基丙酮是否為還原糖？”這一問題。同時，引導學生查找資料，進行理論分析，最后進行實驗驗證。這一過程不僅在課堂上重現了科學研究的經典步驟，即發現問題→提出假設→實驗驗證，還可加深學生對糖的還原性質的理解。同時在實驗結束后，鼓勵學生詳細記錄實驗現象，通過查找資料等方法，對幾種糖的反應過程的現象差異進行討論。

教師在授課過程中會接觸到各種超出教材內容的問題，這些問題看似簡單，但很難找到明確的答案。生物化學是一門實驗科學，直接設計實驗解決的問題，比通過理論推演更令人信服，教師在教學過程中，不僅要傳播理論知識，更要教會學生辯證地思考問題和嚴謹地驗證結論。