環(huán)氧合酶-2在小鼠心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)的時(shí)效及其作用

劉燕飛，李海燕，石剛剛

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

缺血性心臟病是全球主要死亡原因之一。冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致心肌缺氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，直接造成心肌細(xì)胞死亡[1]，通過手術(shù)干預(yù)可以重建血管恢復(fù)血流，即再灌注可以降低心肌壁壞死的程度，同時(shí)也會(huì)誘發(fā)比再灌注前更為嚴(yán)重的心肌損傷，被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI的病理機(jī)制復(fù)雜，常見的有鈣超載、炎癥[2]、活性氧的積累[3]、代謝紊亂以及能量障礙等。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是合成前列腺素的限速酶[4]。它有COX-1和COX-2兩種同工酶。COX-1是結(jié)構(gòu)酶，在大多數(shù)組織中呈組成型表達(dá)，維持細(xì)胞、組織和器官生理功能的穩(wěn)定；COX-2是誘導(dǎo)酶，可以快速應(yīng)答促炎介質(zhì)、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素和脂多糖等的刺激，是觸發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，COX-2在MIRI中扮演的角色存在爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠心臟缺血40 min再灌注24 h模型中，使用COX-2抑制劑塞來昔布治療可以減少心肌梗死面積[5]。在離體研究中發(fā)現(xiàn)H9c2和大鼠原代心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧前預(yù)孵COX-2抑制劑NS-398，可顯著減輕缺氧再?gòu)?fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡[6]。在小鼠心臟缺血30 min再灌注24 h模型中，使用COX-2抑制劑NS-398治療對(duì)心肌梗死面積無(wú)明顯影響[7]。而且有關(guān)COX-2在小鼠MIRI中表達(dá)的時(shí)效尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究在小鼠整體水平結(jié)扎心臟冠狀動(dòng)脈左前降支建立MIRI模型，研究COX-2在MIRI中的表達(dá)時(shí)效，在此基礎(chǔ)上通過COX-2基因敲除小鼠研究COX-2在MIRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型C57BL/6JNifdc小鼠，SPF級(jí)，8～10周齡，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。使用此小鼠研究COX-2在MIRI中表達(dá)的時(shí)效。COX-2基因敲除小鼠由天津醫(yī)科大學(xué)余鷹教授惠贈(zèng)，在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)繁殖。后經(jīng)基因鑒定出野生型小鼠及COX-2基因敲除小鼠用以研究COX-2在MIRI中的作用。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 COX-2抗體(美國(guó)CST公司)；β-Tubulin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；HRP1標(biāo)記山羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；2×Taq酶(美國(guó)Sigma公司)；COX-2基因引物(華大基因公司)。

1.1.3 主要儀器 ALC-V8S小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；垂直電泳儀、PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；全自動(dòng)乳化分散儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；Vevo?LAZR小動(dòng)物多模成像系統(tǒng)(美國(guó)FujiFilm VisualSonics公司)；全自動(dòng)血液生化分析儀(日本東芝公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定 取COX-2敲基因小鼠一小塊耳組織置于1.5 mL EP管底部，加入100 μL 25 mmol/L NaOH溶液(含2 mmol/L EDTA)，100 ℃沸水浴30 min后加入100 μL 40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，振蕩30 s以上，3 000 r/min離心10 s，取1.5 μL上清加至以下PCR反應(yīng)體系：野生、敲除、雜合型COX-2基因引物各0.25 μL，2×Taq酶12.5 μL，H2O 10.25 μL，共計(jì)25 μL。PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 4 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。取10 μL上樣，用1.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行DNA凝膠電泳。

1.2.2 小鼠MIRI模型的建立 小鼠稱重，按每10 g體重0.1 mL的比例腹腔注射1%戊巴比妥鈉。小鼠麻醉后，左胸前部脫毛，固定于手術(shù)臺(tái)上，氣管插管連接呼吸機(jī)，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，剪開小鼠的皮膚、肌肉組織，在第3、4肋骨之間鈍性分離，撕開心包膜暴露出心臟。在小鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支穿線，墊入聚乙烯軟管后進(jìn)行結(jié)扎造成心臟缺血，以心電圖ST段抬高，心尖部發(fā)白為缺血成功標(biāo)志。取掉軟管，剪開結(jié)扎線，以ST段下降為再灌注成功標(biāo)志。模型(Model)組小鼠按上述方法缺血1 h再灌注4 h建立MIRI模型，假手術(shù)(Sham)組小鼠只穿線不結(jié)扎。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 時(shí)效研究分組：假手術(shù)組(Sham組)、缺血15 min組、缺血30 min組、缺血45 min組、缺血60 min組；Sham組、缺血1 h再灌注1 h組、缺血1 h再灌注2 h組、缺血1 h再灌注3 h組、缺血1 h再灌注4 h組、缺血1 h再灌注5 h組、缺血1 h再灌注6 h組。因果研究分組：野生型小鼠假手術(shù)組(WT Sham組)、COX-2基因敲除小鼠假手術(shù)組(KO Sham組)、野生型小鼠缺血1 h再灌注4 h組(WT Model組)、COX-2基因敲除小鼠缺血1 h再灌注4 h組(KO Model組)。

1.2.4 心肌總蛋白的提取 取小鼠心臟結(jié)扎線以下部分用生理鹽水洗去多余的血液，用濾紙吸干后稱重，置于1.5 mL EP管中，按100 mg心肌組織加1 mL裂解液的比例加入現(xiàn)配的RIPA裂解液(V裂解液∶VPMSF=50∶1)，把心臟組織剪碎，乳化分散儀研磨組織至無(wú)明顯組織塊，冰上靜置30 min，每隔10 min振蕩1次，然后13 000 r/min 4℃離心15 min，取上清210 μL于另一1.5 mL EP管中，取10 μL上清稀釋50倍后用BCA法測(cè)蛋白濃度，剩余200 μL上清中加入5×蛋白上樣緩沖液50 μL，沸水中煮5 min，室溫冷卻后-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Western blot檢測(cè)COX-2蛋白表達(dá) 計(jì)算50 μg的蛋白量上樣體積，將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，先50 V恒壓至樣品過濃縮膠，然后將電壓調(diào)至100 V跑分離膠約80 min，用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，麗春紅染色觀察蛋白條帶，切出目的條帶及內(nèi)參條帶，用5%的牛奶封閉1 h，4℃過夜孵育COX-2一抗(1∶1 000稀釋)。第2天條帶先用TBST緩沖液洗3次，每次10 min，然后室溫孵育二抗1.5 h，條帶用TBST緩沖液洗3次，每次10 min。把條帶放入暗盒，滴加發(fā)光液反應(yīng)2 min，在暗房用X膠片壓片，然后顯影、定影。ImageJ圖像分析軟件分析蛋白條帶的光密度。

1.2.6 小動(dòng)物多模成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠心功能 用異氟烷氣體麻醉系統(tǒng)快速麻醉小鼠，把小鼠固定于操作板上，用脫毛膏將小鼠左胸前部毛發(fā)脫除干凈，涂抹上適量的耦合劑，超聲探頭置于耦合劑上，調(diào)整探頭位置使探頭橫切心臟長(zhǎng)軸，分別保存M-Mode和B-Mode模式圖像，用Vevo LAB 3.0.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 小鼠血清心肌酶中肌酸激酶的檢測(cè) 取小鼠血液約0.5 mL于1.5 mL EP管中，靜置0.5 h，然后3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清10 μL用生理鹽水稀釋64倍，取100 μL稀釋后的樣品于全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)肌酸激酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2在小鼠MIRI中表達(dá)的時(shí)效研究

2.1.1 心肌缺血時(shí)COX-2表達(dá)情況 隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2的表達(dá)逐漸升高，在缺血60 min時(shí)表達(dá)最高，與Sham組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 小鼠心肌缺血期間COX-2的表達(dá)

2.1.2 心肌缺血再灌注時(shí)COX-2表達(dá)情況 心肌缺血1 h后隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2的表達(dá)先逐漸升高，再灌注4 h達(dá)高峰后趨于穩(wěn)定，與Sham組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 小鼠心肌缺血再灌注期間COX-2的表達(dá)

2.2 小鼠基因型鑒定

正常表達(dá)的COX-2基因完整DNA序列為800 bp，刪除400 bp后造成基因突變，不表達(dá)COX-2基因。根據(jù)DNA凝膠電泳結(jié)果（圖3），野生型小鼠僅有800 bp DNA條帶，COX-2基因敲除小鼠僅有400 bp DNA條帶。雜合子小鼠既有800 bp又有400 bp DNA條帶，鑒定后予以剔除，不用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 DNA凝膠電泳結(jié)果

2.3 COX-2與MIRI的因果關(guān)系研究

2.3.1 COX-2基因敲除對(duì)MIRI的影響 WT Sham組和KO Sham組左室射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率、左室舒張末期內(nèi)徑和左室舒張末期容積比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與WT Sham組相比，WT Model組左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率明顯降低，左室舒張末期內(nèi)徑和左室舒張末期容積明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與WT Model組相比，KO Model組左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率明顯升高，左室舒張末期內(nèi)徑和左室舒張末期容積明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 COX-2基因敲除對(duì)缺血再灌注所致的小鼠心功能損傷的影響

2.3.2 COX-2基因敲除對(duì)缺血再灌注所致的肌酸激酶漏出的影響 WT Sham組和KO Sham組肌酸激酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與WT Sham組相比，WT Model組肌酸激酶活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與WT Model組相比，KO Model組肌酸激酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 COX-2基因敲除對(duì)缺血再灌注所致的肌酸激酶漏出的影響

3 討論

COX-2是誘導(dǎo)酶，在正常組織中表達(dá)較低，在不同的刺激下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)[8]。越來越多的證據(jù)表明，COX-2在心肌缺血時(shí)高表達(dá)，提示COX-2的誘導(dǎo)可能參與缺血性心臟病[9]。有研究發(fā)現(xiàn)在MIRI動(dòng)物模型中，缺血預(yù)處理后COX-2的表達(dá)對(duì)心臟具有保護(hù)作用[10-11]。但也有不少研究發(fā)現(xiàn)，COX-2表達(dá)的增強(qiáng)在心肌損傷的發(fā)展中起著有害的作用。在大鼠[5,12-13]、兔[14]和狗[15]等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，使用COX-2特異性抑制劑治療可顯著改善心功能，減少心肌梗死面積。

本研究發(fā)現(xiàn)正常情況下COX-2在小鼠心肌組織中低表達(dá)，心肌缺血后COX-2的表達(dá)逐漸升高，固定缺血時(shí)間為1 h，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2表達(dá)逐漸升高，于4 h達(dá)高峰后趨于穩(wěn)定，表明雖然COX-2在心肌缺血時(shí)開始被誘導(dǎo)高表達(dá)，但再灌注對(duì)COX-2高表達(dá)的誘導(dǎo)更加明顯。在此基礎(chǔ)上觀察野生型小鼠和COX-2基因敲除小鼠的心功能，正常情況下兩種小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率、左室內(nèi)徑、左室容積和肌酸激酶基礎(chǔ)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明COX-2基因敲除后不影響小鼠正常心功能和肌酸激酶的漏出；在心肌缺血1 h再灌注4 h后，野生型小鼠左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率明顯降低，左室內(nèi)徑、左室容積和肌酸激酶漏出明顯升高，與野生型模型組小鼠相比，COX-2基因敲除小鼠左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率升高，左室內(nèi)徑、左室容積和肌酸激酶漏出明顯降低，表明COX-2是造成小鼠MIRI的主要原因之一。

綜上所述，隨著小鼠心肌缺血或再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，COX-2蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性地升高，COX-2的高表達(dá)是造成MIRI的重要原因，也是干預(yù)MIRI的潛在靶標(biāo)。