化學發光聯合免疫組化技術對不同類型子宮內膜異位癥的鑒別診斷

柳燕飛，劉雯雯，郭蕾，張藝，高天旸

(廣東省第二人民醫院，廣東 廣州 510317)

子宮內膜異位癥(EMT)是誘發不孕不育以及盆腔疾病等的常見病因，異位宮頸內皮細胞具有多位置定植的特點，其中卵巢型EMT、深部浸潤EMT以及腹膜型EMT的發生率最高，且危害性較大[1]。目前EMT仍缺乏有效的治療藥物，傳統的診斷主要采用影像學診斷及免疫組化技術，這些方法存在診斷時間長、深部組織干擾大以及血清指標(如癌胚抗原125)可變性大等缺陷[2]。隨著EMT研究的不斷深入，研究者發現可通過免疫因子、血管新生以及血清炎癥因子水平鑒別EMT，但對于不同異位部位EMT的鑒別仍缺乏可靠指標[3]。基于上述問題，本研究選擇免疫組化聯合磁珠化學發光方法，對卵巢型EMT、深部浸潤EMT以及腹膜型EMT實施生物學診斷研究。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年2月—2020年2月我院收治的90 例患有不同類型子宮內膜異位癥患者為研究對象，經B超及內鏡檢測，依據患病部位不同將其分為卵巢子宮內膜異位癥(A組，30 例)、深部子宮內膜異位癥(B組，30 例)、腹壁切口子宮內膜異位癥(C組，30 例)，所有患者術前1個月均無激素治療史。A組，年齡(32.3±4.16) 歲；按子宮內膜異位癥分期標準(R-AFS)，Ⅱ期24 例，Ⅲ期6 例；病程(2.12±0.43) 周。B組，年齡(32.84±3.67) 歲；R-AFS分期Ⅱ期25 例，Ⅲ期5 例；病程(2.23±0.46) 周。C組，年齡(32.67±3.33) 歲；R-AFS分期Ⅱ期26 例，Ⅲ期4 例；病程(2.34±0.52) 周。三組患者在年齡、R-AFS分期占比及病程方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，有可比性。

1.2 納入及排除標準

納入標準：經B超、內鏡及手術切除檢測均符合《婦產科學》(第8版)關于子宮內膜異位癥臨床判定標準；無其他宮頸并發癥(如宮頸肌瘤等)；無其他臟器如肝臟、心臟及腎臟等系統性疾病；經R-AFS分期評估為Ⅱ期或Ⅲ期。排除標準：患者有其他宮頸疾病并發癥或宮頸惡性腫瘤等；患有精神障礙性疾病或溝通障礙性疾病；患者及家屬對治療不知情或未簽訂知情同意書；患者已絕經或處于哺乳期。

1.3 檢測方法

所有患者在內鏡及影像學診斷輔助下，行外科手術治療及異位子宮病灶組織采集，病灶面積為0.5～1 cm2，嚴格分離患部及周圍組織。采集分離病灶給予編號，并嚴格執行我院鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法(SABC)進行免疫組化染色，一抗分別為兔抗人CD4+CD25+Treg抗體、兔抗人Foxp3抗體(ab4728，Abcam)、血管緊張素Ⅱ受體-1(AT1R)(ab124505)及兔抗人血管內皮生長因子(VEGF)抗體(ab42802，Abcam)，每例患者重新檢測一次，經4 ℃過夜；二抗為Biotin標記的羊抗兔抗體(A0277，上海碧云天生物技術有限公司)，封閉孵育后加入相同生物素標記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育30 min后加入SABC顯色劑(武漢博士德生物公司)，并于倒置顯微鏡下進行顯色觀察，加入顯色劑10 min后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)及去離子水洗，晾干加入Harris蘇木素核染10 s，之后水洗并封片。患者接受治療期間同步進行血清采集，用無抗凝劑的采樣器抽外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min后，吸取上層血清分裝為兩管并做好標記，一管置于-80 ℃冰箱保存，另一管進行化學發光法免疫學檢測，測定項目包括雌二醇(E2)(安圖生物)、血清卵泡刺激素(FSH)(西門子醫學診斷產品上海分公司)、黃體生成素(LH)(安圖生物)及腹腔積液內層粘連蛋白(LN)(天津博奧賽斯生物科技有限公司)。各種抗體的化學發光檢測步驟均嚴格依照說明書執行。

1.4 評價指標

比較不同類型子宮內膜異位癥患者的Foxp3，CD4+CD25+Treg，VEGF及AT1R陽性表達率。染色細胞質或細胞膜呈棕黃色為陽性，陽性表達率=陽性例數/總例數×100%。比較不同類型子宮內膜異位癥患者E2，FSH，LH及LN水平變化。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 不同類型子宮內膜異位癥中Foxp3和CD4+CD25+Treg表達率比較

C組Foxp3及CD4+CD25+Treg陽性表達率顯著低于其余兩組(P<0.05)，其中A組的陽性率最高；C組AT1R的陽性表達率顯著高于其余兩組(P<0.05)；B組VEGF的陽性表達率顯著高于其余兩組(P<0.05)(見表1)。

表1 不同EMTs中Foxp3和CD4+CD25+Treg表達率比較 例(%)

2.2 不同類型子宮內膜異位癥患者各項指標比較

B組E2水平顯著高于其余兩組(P<0.05)；A組的FSH水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，同時A組的LH水平顯著高于其余兩組(P<0.05)；C組的LN水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，其中B組的LN水平最高(見表2)。

表2 不同類型子宮內膜異位癥患者各項檢查指標比較

3 討 論

子宮內膜異位癥是子宮內膜活體組織(如腺體細胞等)定植于宮頸外不同組織并浸潤生長誘發的一種疾病[4]。研究[5-6]發現，機體對異位細胞產生免疫耐受是EMT發生的主要原因。章舒等[5]證實淋巴T細胞調節基因Foxp3啟動了T調節細胞的免疫抑制，從而導致異位細胞無法被機體免疫清除而誘發異位生長，除此之外，異位細胞生長中新生血管的產生是異位生長細胞營養供應的主要來源。有研究[7]證實，除免疫耐受外，外科剖宮產手術容易誘發腹壁型EMT。鐘文萱等[7]采用免疫組化檢測腹壁異位子宮內膜組織和正常子宮內膜組織AT1R與血管緊張素Ⅱ受體-2(AT2R)蛋白的表達，結果顯示，與正常子宮內膜組織相比，腹壁型EMT患者子宮內膜組織的AT1R呈強陽性表達。目前主要采用化學發光技術及酶聯免疫反應檢測血清VEGF，LN及E2等以監測EMT的發病部位[8-9]。但是，因為這些標記物在血清或腹腔積液中具有可變性，同時深部浸潤型EMT的生物學檢測報道較少，因此仍需進一步深入研究。本研究基于國內外相關報道，從免疫調節及血管新生角度對不同生物分子在不同類型EMT中的表達進行研究，結果顯示A組Foxp3及CD4+CD25+Treg的陽性表達率顯著高于其余兩組(P<0.05)，初步說明免疫抑制調節對卵巢型EMT的發生起重要作用。C組AT1R陽性率顯著高于其余兩組(P<0.05)，初步說明AT1R對腹壁型EMT的發生有重要作用。B組VEGF陽性率顯著高于其余兩組(P<0.05)，初步說明深部浸潤型EMT患者的發生過程中VEGF起關鍵作用。子宮內膜腺體細胞是分泌E2的重要細胞，因此E2水平監測對深部浸潤型EMT患者的鑒定具有重要輔助價值。本研究B組的E2水平顯著高于其余兩組(P<0.05)。A組的FSH水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，同時A組的LH水平顯著高于其余兩組(P<0.05)，說明了卵巢型EMT患者由于異位細胞生長，可抑制FSH的分泌，間接解決了黃體抑制排卵導致的不孕不育。C組的LN水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，說明內層腹腔積液粘連細胞在深部浸潤型EMT中呈現高表達。

綜上所述，在目前缺乏特定性生物標記分子的條件下，可通過多項技術的聯合對不同類型子宮內膜異位癥進行鑒別，同時聯合檢測Foxp3，CD4+CD25+Treg，LH，E2，LN，FSH及AT1R，可有效鑒別不同類型EMT。