Ⅰ型膠原酶對人牙周膜膠原蛋白構(gòu)象影響的拉曼光譜研究

劉 懋，唐苗寧，管佳妮，謝理哲，吳 斌，顧敏芬，嚴 斌

牙周膜是連接牙根與牙槽骨的致密結(jié)締組織，厚度為0.15～0.38 mm，具有承載和傳導力、調(diào)節(jié)和緩沖咀嚼壓力的作用。牙周膜的組成成分包含膠原纖維、非彈性纖維、基質(zhì)、細胞等[1]，其中，膠原纖維包括多種分型，以Ⅰ型膠原含量最多，占牙周膜的78.06%[2]，主要由膠原蛋白構(gòu)成，能夠抵抗牽拉力。牙周膜在正畸力刺激下的生物力學響應(yīng)，對牙槽骨的改建起調(diào)控作用。牙周膜中膠原蛋白的合成與降解，在正畸牙移動過程中起著重要作用[3]。

Ⅰ型膠原纖維構(gòu)成了牙周膜的主體，其主要成分為膠原蛋白。膠原蛋白是結(jié)締組織中的一種結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)，具有多樣的分子構(gòu)象，膠原分子的有序排列使膠原纖維具有一定的強度和韌性[4]。以往對于牙周膜膠原的生物力學研究，主要集中于力刺激對膠原蛋白表達的影響， Xu等[5]在大鼠正畸牙移動模型中，通過免疫組化染色和Western blot的方法發(fā)現(xiàn)牙周膜張力側(cè)Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達上調(diào)。Komatsu等[6]探究了膠原的機械性破壞對力學響應(yīng)的影響，通過使用Ⅲ型膠原酶處理大鼠牙周膜，觀察到牙周膜纖維的形態(tài)學改變，同時力學實驗中最大剪切力減小。KarisAllen等[7]發(fā)現(xiàn)高溫會使膠原蛋白受到機械性損傷，破壞纖維交聯(lián)，從而出現(xiàn)膠原纖維密度改變。然而，現(xiàn)有的研究主要以膠原含量的表征為主，而膠原蛋白本身復雜的空間構(gòu)象對蛋白質(zhì)功能有重要作用[8]，目前，在分子水平上，牙周膜膠原蛋白的空間結(jié)構(gòu)改變?nèi)绾斡绊懷乐苣ぬ匦匀晕幢魂U明。

近年來，拉曼光譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學材料的檢測[9]，具有對多種功能基團敏感、高特異性、無損的特點。在口腔黏膜病、牙周炎、口腔癌的診斷上也開展了臨床研究[10]，通過檢測組織樣本的分子結(jié)構(gòu)改變，為早期診斷口腔疾病提供了可能。但是，由于牙周膜材料尺寸較小，并且難以完整獲取，故以往拉曼光譜較少應(yīng)用于牙周膜研究[11]。共聚焦顯微拉曼光譜結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，提高了檢測精確度，同時不受樣本保濕條件的影響，故適用于研究微小的牙周膜膠原改性的結(jié)構(gòu)變化。

本文以人牙周膜樣本為研究對象，針對牙周膜中含量最豐富的Ⅰ型膠原，通過Ⅰ型膠原酶處理模擬膠原降解，進行顯微拉曼光譜檢測，分析牙周膜膠原改性后膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化，為深入研究牙周膜的生物力學特性提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料和儀器

健康人上頜骨1個[南京醫(yī)科大學倫審(2019)324號]。Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)。

低速切割機(500 r/s,IsoMet，Buehler，美國)，金剛石刀片(φ100 mm×φ12.7 mm×0.4 mm,科晶，中國)。激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution，HORIBA，法國)。

拉曼光譜分析軟件Labspec(version 6，HORIBA，法國)；光譜分峰擬合軟件Peakfit(version 4.12，Seasolve，美國);圖表繪制分析軟件Origin(version 2018, origin-lab，美國)。

1.2 樣本制備

將人上頜骨頰腭側(cè)黏膜組織剝離，利用手工鋸分離獲得包括2顆上頜前磨牙的塊狀牙齒組織。使用低速切割機將切下的塊狀樣本沿垂直于牙齒長軸的方向自牙槽嵴頂至根尖段，切割成2 mm厚的薄片各3片。

每一薄片再使用低速切割機進行樣本的制備。使用金剛石刀片垂直于牙薄片，沿牙中心部位將樣本分割為4條均包含“牙齒-牙周膜-牙槽骨”的三明治長條狀樣本(圖1A)。將制備好的樣本放入裝有生理鹽水溶液的試管中并置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 樣本分組

選取牙根中部的樣本，將同一牙位的近中、遠中兩條長條樣本隨機劃分進膠原酶處理組和對照組，每組包含3個樣本。

1.4 膠原酶處理

Ⅰ型膠原酶溶液配制：將Ⅰ型膠原酶溶解于緩沖液，制成10 mg/mL[12]的膠原酶溶液。

將酶處理組的牙周膜樣本放入37 ℃水浴鍋化凍，PBS沖洗樣本后，置入Ⅰ型膠原酶溶液浸泡2 h，取出樣本，置入PBS溶液浸泡3次，每次10 min。最后將樣本放回含生理鹽水試管中-20 ℃保存。

1.5 拉曼光譜檢測

實驗當天將處理組和對照組的樣本均提前化凍，6個樣本依次使用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(圖1B)進行檢測。參考Perillo[11]的方法設(shè)定參數(shù)，儀器的激發(fā)波長為633 nm，放大倍數(shù)50倍，積分時間為30 s，光譜范圍200～2 000 cm-1，累計3次。

A：牙周膜樣本 B：拉曼光譜儀

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗獲得人牙周膜樣本拉曼光譜曲線，通過拉曼光譜分析軟件Labspec 6 進行基線校正，用Peakfit軟件(v4.12)對樣本光譜酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶進行高斯擬合，得到圖譜的特征峰強度和峰面積，求得膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)各組分的相對百分比含量，使用圖像繪制軟件Origin (2018版本)進行曲線圖繪制。

2 結(jié) 果

2.1 牙周膜拉曼光譜曲線

如圖2所示，牙周膜的拉曼光譜特征峰主要包括： 853 cm-1處的酪氨酸，935 cm-1處的C—C伸縮振動，1 005 cm-1處的苯丙氨酸，1 459 cm-1處的CH2， 1 200～1 350 cm-1的酰胺Ⅲ帶，1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ帶。膠原酶處理組和對照組的牙周膜的顯微拉曼光譜圖展現(xiàn)在圖2中,主鏈的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的譜峰強度在膠原酶處理組和對照組不同，表明蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖2 Ⅰ型膠原酶處理組和對照組的牙周膜樣本顯微拉曼光譜Fig.2 Micro-Raman spectra of periodontal ligament samples in control group and collagenase Ⅰ treatment group

2.2 酰胺Ⅲ帶的高斯擬合圖譜分析

對各組牙周膜樣本的拉曼圖譜在1 200～1 350 cm-1范圍的酰胺Ⅲ帶進行分峰,得到子峰的譜線，并進行高斯擬合(圖3)。圖中表明，在正常組牙周膜樣本中，酰胺Ⅲ帶可見4根譜線，分別在1 239 cm-1(β-折疊)，1 252 cm-1(無規(guī)卷曲),1 272 cm-1(α-螺旋),1 289 cm-1(β-回折)。在膠原酶處理后，4根譜線的峰高均減小，峰位出現(xiàn)了偏移(表1)，分別對應(yīng)α-螺旋、β-折疊、β-回折結(jié)構(gòu)發(fā)生了向右的紅移，無規(guī)卷曲發(fā)生了向左的紫移。

根據(jù)特征峰位使用Peakfit軟件進行高斯擬合，獲得各子峰的峰面積，以各峰面積占總面積的百分比值作為各二級結(jié)構(gòu)的相對含量(表2)。正常牙周膜中，酰胺Ⅲ帶各二級結(jié)構(gòu)的含量如表2所示，α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對含量最大，占61%，其余結(jié)構(gòu)的相對含量由大到小依次為：無規(guī)卷曲、β-折疊，β-回折。通過膠原酶的降解，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量降低，由61%下降到9%，無規(guī)卷曲和β-折疊、β-回折的相對含量增加，可能是膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化[13]。

A：酶處理組；B：對照組

表1 膠原酶處理組和對照組膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)光譜帶歸屬Tab.1 Spectral band assignment of collagen secondary structure in control group and collagenase Ⅰ treatment group

2.3 酰胺Ⅰ帶的高斯擬合圖譜分析

圖2表明，牙周膜膠原蛋白酰胺Ⅰ帶分布在1 600～1 700 cm-1范圍，進行分峰得到4根二級結(jié)構(gòu)譜線(圖4)。與正常牙周膜相比，經(jīng)過膠原酶降解的牙周膜樣本的α-螺旋、310-螺旋的相對含量增加，β-折疊的比值有所減小，β-回折的比值基本不變。此外，各結(jié)構(gòu)的峰中心也出現(xiàn)了偏移(表1)。

表2 膠原酶處理組和對照組酰胺Ⅲ帶二級結(jié)構(gòu)含量百分比Tab.2 The percentage of secondary structure of amide Ⅲ band in control group and collagenase Ⅰ treatment group

A：酶處理組；B：對照組

3 討 論

本研究使用拉曼光譜儀對牙周膜膠原蛋白的功能基團精準檢測，從分子層面探究膠原蛋白構(gòu)象的變化。實驗獲得了牙周膜的拉曼光譜圖，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白的特征峰主要集中在酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅲ帶、CH2以及C—C鍵伸縮振動，這與Perillo的研究結(jié)果基本一致[11]，除此之外研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸和苯丙氨酸也顯示了特征性的吸收峰。證明顯微拉曼檢測可應(yīng)用于牙周膜微觀構(gòu)象的研究。

牙周膜由多種膠原組成，其中主要是Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型膠原，分別占75%[14]～78.06%[2]、20%、5%[15]。Ⅰ型膠原是結(jié)締組織中結(jié)構(gòu)蛋白的一種，廣泛存在于皮膚、韌帶等，是組織代謝和力學性能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在牙周膜成分中的含量最多，構(gòu)成了Ⅰ型膠原纖維。以往研究表明， 牙周膜Ⅰ型膠原的基因表達隨著牙周膜細胞的機械負載而改變[16-18]，在張力側(cè)、高咬合力處膠原表達增加。膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)可分為四級，其含量和排列決定了蛋白質(zhì)的生物學活性。崔素萍等[19]發(fā)現(xiàn)，蛋白的二級結(jié)構(gòu)會對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響。蛋白二級結(jié)構(gòu)指主鏈原子的空間構(gòu)象，主要包括：α-螺旋、β-折疊、β-回折、無規(guī)卷曲。其中，α-螺旋的肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成，具有相當?shù)姆€(wěn)定性，與牙周膜的彈性性能有關(guān)[11]。在本研究中，膠原蛋白在處理前后的拉曼光譜圖在酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶發(fā)生變化。在酰胺Ⅲ帶中，α-螺旋的相對含量減少，而β-回折、β-折疊和無規(guī)卷曲的含量增加。這說明膠原酶降解后，可能發(fā)生了二級結(jié)構(gòu)的互相轉(zhuǎn)化，并表現(xiàn)為膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和性能的改變，α-螺旋維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的鏈內(nèi)氫鍵可能被破壞[20]。在酰胺Ⅰ帶中，α-螺旋的相對含量增加，β-折疊的相對含量減小，這表明牙周膜在膠原酶處理后，蛋白的二級結(jié)構(gòu)改變，破壞了蛋白的穩(wěn)定性，可能影響牙周膜的生物力學性能[21]。

Ⅰ型膠原酶在生理條件下能夠特異性地水解Ⅰ型膠原蛋白的空間結(jié)構(gòu)，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織[22]。因此，本實驗特異性研究了Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化。但是，膠原酶本身也是一種蛋白質(zhì)，不能忽略Ⅰ型膠原酶本身在拉曼檢測中對實驗結(jié)果的影響，在樣本處理時需使用PBS緩沖液反復沖洗樣本以去除樣本表面的膠原酶殘留。

膠原纖維的降解出現(xiàn)在正畸治療或牙周潔治后牙齦炎癥緩解時[23-24]。在正畸治療中，患有嚴重牙周炎的錯牙合畸形患者的牙齒移動速率較正常減慢，這可能與牙周膜膠原結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)[25-26]。但是本研究僅探究了牙周膜樣本的蛋白結(jié)構(gòu)改變，在未來研究中，應(yīng)當考慮與力學實驗相結(jié)合，以進一步定性定量探究蛋白結(jié)構(gòu)對牙周膜特性的影響。

4 結(jié) 論

本文通過顯微拉曼光譜檢測初步探究了人前磨牙牙周膜在Ⅰ型膠原酶處理后膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化，證明拉曼光譜應(yīng)用于牙周膜樣本的可行性。實驗獲得了人牙周膜的拉曼光譜圖的特征峰，發(fā)現(xiàn)膠原酶處理后牙周膜膠原蛋白在酰胺Ⅲ帶和酰胺Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)光譜圖的特征峰位和峰面積改變，在酰胺Ⅲ帶的二級結(jié)構(gòu)相對含量的比值改變，提示牙周膜膠原降解后膠原蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性被破壞，可能會降低牙周膜的力學性能，為進一步研究牙周膜生物力學特性提供參考。