原料乳加工過程中嗜冷菌研究進展

張 峰，張雅婷，張虹玉，賽乃瓦爾·艾合坦木，夏永軍，艾連中，熊智強

上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093

國際乳業(yè)聯(lián)合會提出，7 ℃以下能生長的細菌為低溫菌，而20 ℃以下能夠繁殖的細菌為嗜冷菌[1]。嗜冷菌在原料乳低溫貯藏、加工運輸過程中廣泛存在。原料乳作為奶粉、成品奶和奶酪等乳制品生產(chǎn)的基本原料，其在生產(chǎn)和加工中的質(zhì)量問題尤為突出。原料乳污染最常發(fā)生在灌裝和低溫儲存過程中，而機器上冷凝水和灌裝機不清潔也易造成牛奶污染[2]。原料乳中假單胞菌等嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶和脂肪酶[3]，會水解牛奶中的乳清蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白和甘油三脂，導致牛奶品質(zhì)顯著下降。本文針對嗜冷菌及胞外酶的檢測和影響機制展開綜述，為原料乳中嗜冷菌及胞外產(chǎn)物的控制提供理論依據(jù)。

1 原料乳加工期間常見嗜冷菌

由于奶牛乳房、擠奶設(shè)備和擠奶室環(huán)境存在微生物[4]，原料乳極易受到嗜冷菌等微生物的污染(表1)。雷鳴等[5]通過16S rRNA高通量測序發(fā)現(xiàn)原料乳中嗜冷菌以黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬為主，其中假單胞菌屬是危害最大的嗜冷菌。原料乳在加工時同樣存在污染，如巴殺奶發(fā)生在灌裝作業(yè)中的污染，以假單胞菌為主[6]。我們課題組采用變性梯度凝膠電泳和高通量測序分析嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)過程中細菌群落結(jié)構(gòu)變化和分布，發(fā)現(xiàn)原料乳階段主要的微生物污染為假單胞菌屬，而奶粉產(chǎn)品中主要菌群為乳球菌屬、鏈球菌屬、棲熱菌屬、不動桿菌屬和擬桿菌屬[7]。乳清干酪也容易受假單胞菌等嗜冷菌的二次污染，主要是工廠包裝過程的人工污染[8]。原料乳中主要微生物為假單胞菌，而經(jīng)巴氏殺菌后地衣桿菌的比例顯著增加，其次為乳球菌和鏈球菌。

表1 原料乳加工過程中常見的微生物污染源

2 嗜冷菌在原料乳加工過程中的影響

嗜冷菌污染在原料乳加工中普遍存在，危害主要表現(xiàn)為嗜冷菌產(chǎn)生具有耐熱性胞外酶，能水解牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等營養(yǎng)物質(zhì)。特別是牛奶儲藏時間過長或者高溫殺菌后溫度沒有及時降低，嗜冷菌快速生長并產(chǎn)生大量蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶，它們能分解乳制品中的脂肪、蛋白質(zhì)和卵磷脂，導致產(chǎn)品凝結(jié)、分層、產(chǎn)生苦味等不良性狀，嚴重影響產(chǎn)品貨架期[9]。

2.1 脂肪酶對原料乳影響

嗜冷菌所產(chǎn)脂肪酶按照家族分為八個家族I、II(GSDL)、III、IV(HSL)、V、VI、VII和VIII，其最大家族I分為六個亞家族[10]。脂肪酶屬于水解酶類，作用于羧酸酯的酯鍵，三酰基甘油作為底物水解成脂肪酸，二酰基甘油，單酰基甘油和甘油，導致腐臭、酸敗或肥皂味[11]。它們大多對三酰甘油的sn-1和sn-3位置具有特異性，但對二酰甘油和單酰基甘油的水解速度比三酰甘油快。脂肪酶除水解三酰基甘油外，還能夠催化氧化酯化產(chǎn)生酯交換、酸解、醇解及氨解等反應[12]。嗜冷菌所產(chǎn)脂肪酶對包裹脂肪球的脂肪球膜進行破壞，使其失去對脂肪的保護作用,嚴重破壞乳制品中的脂肪[13]。假單胞菌、黃桿菌和不動桿菌[14]是原料乳中脂肪水解能力較強的嗜冷菌。多數(shù)假單胞菌脂肪酶可抵抗奶制品工業(yè)中的巴氏殺菌和UHT處理。特別是嗜冷菌所產(chǎn)耐熱脂肪酶在130 ℃ 15 s商業(yè)高溫滅菌后仍能保持活性，導致乳脂脂解和酸敗，生成大量游離脂肪酸。

2.2 蛋白酶對原料乳的影響

耐熱蛋白酶能夠水解a-casein 和β-casein，破壞乳脂肪球和酪蛋白表面結(jié)構(gòu)，引起脂肪與脂肪、脂肪與酪蛋白結(jié)合并聚集，形成小薄片浮于奶上層[15]。嗜冷菌蛋白酶具有高熱穩(wěn)定性和強復性能力，在高溫處理后，沒有完全滅活的蛋白酶分子可以重新折疊形成具有空間活動的螺旋結(jié)構(gòu)[16]。乳品保藏過程中蛋白酶會分解蛋白質(zhì)，導致乳品感官品質(zhì)和物理環(huán)境化學結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化，降低乳品營養(yǎng)價值，縮短產(chǎn)品保質(zhì)期。蛋白酶與牛奶中苦味、UHT奶凝膠化密切相關(guān)。由aprX基因編碼的蛋白酶具有非常好的熱穩(wěn)定性。WOODS等[17]發(fā)現(xiàn)aprX-inh-aprDEF-prtAB-lipA構(gòu)成一個獨立轉(zhuǎn)錄單位，通過構(gòu)建突變體和aprX定量分析確定每個基因的功能。MAIER等[18]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬有22種aprX-lipA2操縱子，而含prtAB 的I型操縱子結(jié)構(gòu)菌株大部分蛋白水解活性最高。而假單胞中aprX-LipA2基因簇主要以I、II、III和VI類型存在(圖1)，帶有prtAB的I型操縱子(aprXIDEFprtABlipA2)顯示出最強的蛋白水解活性，但目前為止未發(fā)現(xiàn)PrtAB具有活性。具有II型操縱子結(jié)構(gòu) (AprXIDEFlipA2)被認為是低酶活菌株。具有III型操縱子(aprXIDEFprtABlipA1A2)，在prtAB的下游有一個脂肪酶基因(lipA1)，但蛋白水解活性比I型低。具有VI型結(jié)構(gòu)的分離株(aprXIDEF∥prtAB)對蛋白水解潛力較大，酶活從低到高都存在，而不含aprX-lipA2基因簇的菌株都不具有酶活。

雙斜杠(∥)表示基因簇被分隔圖1 假單胞菌蛋白酶常見的基因類型

2.3 磷脂酶對原料乳的影響

磷脂在穩(wěn)定乳脂球中起關(guān)鍵作用，磷脂酶降低乳脂球膜的完整性，促進天然脂肪酶脂解作用。乳制品的“奶油味”通常由卵磷脂酶活性引起[19]。目前研究最多的是磷脂酶C，它分為溶血和非溶血性，且耐熱性非常好。VITHANAGE等[20]在原料乳中檢測到假單胞菌屬，芽孢桿菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞屬，不動桿菌屬和微細菌屬中磷脂酶C活性，約25%菌株140 ℃熱處理4 s后還保留50%～75%的活性。KOKA等[21]發(fā)現(xiàn)嗜冷菌產(chǎn)生的磷脂酶能耐受巴氏殺菌和UHT處理，導致牛奶變質(zhì)。因此，在加工過程中應盡可能減少乳制品中殘留的磷脂酶活性。

2.4 毒素對原料乳的影響

原料乳中毒素主要由芽孢桿菌等嗜冷菌產(chǎn)生，毒素影響原料乳品質(zhì)且潛在危害人體健康。例如，SAMARIJA等[22]從乳品生產(chǎn)鏈中分離的嗜冷菌等菌株本身不具有致病性，但適宜條件下能夠產(chǎn)生腸毒素、外毒素和蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)毒素等致病因子，導致致病性。MIKKOLA等[23]分離出地衣芽孢桿菌毒素，鑒定為地衣素A，是一種環(huán)狀內(nèi)酯七肽，其3-羥基脂肪酸的長度為13～15個碳原子。NIEMINEN等[24]從牛乳汁中分離出短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等菌株，其產(chǎn)生的毒素熱穩(wěn)定性好，可溶于甲醇，不屬于蛋白質(zhì)。短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌不但能產(chǎn)生毒素，還能以孢子形式在巴氏殺菌和其它商業(yè)熱處理中存活，而這些微生物的來源可能是有乳腺炎病史的奶牛，含有這些細菌的牛奶甚至會對奶粉產(chǎn)品安全性造成威脅。

3 原料乳中嗜冷菌及其胞外酶檢測

3.1 原料乳中嗜冷菌檢測

LAW等[25]研究表明當原料乳中嗜冷菌數(shù)低于8×106CFU/mL，UHT乳的貨架期約為六個月；但嗜冷菌數(shù)達5.0×107CFU/mL時，UHT乳僅12 d就會陳化凝膠。為保證乳產(chǎn)品的保質(zhì)期，原料乳中嗜冷菌的檢測尤其重要。國標SN/T 2552.4-2010中嗜冷菌檢測方法是將原料乳在6.5 ℃下培養(yǎng)10 d計數(shù)，該方法能夠準確計數(shù)，但周期過長和只能檢測活菌數(shù)[26]。VILAR等[27]采用ATP生物熒光法對乳品廠牛奶設(shè)備表面細菌數(shù)(主要是革蘭氏陰性嗜冷菌)進行檢測，其結(jié)果可作為擠奶設(shè)備清潔的依據(jù)。MANZANO等[28]建立兩種基于嗜冷菌的氨基肽酶檢測方法，可2.5 h內(nèi)對生奶質(zhì)量進行評估，具有良好相關(guān)性，其間接法靈敏度為2×104CFU/mL，滿足多數(shù)國家規(guī)定所需檢測水平，且該方法成本低，需要的設(shè)備在許多實驗室都能滿足(如培養(yǎng)箱、恒溫浴，離心機和分光光度計等)。國內(nèi)外關(guān)于嗜冷菌快速檢測技術(shù)已有大量報道(表2)。例如，關(guān)晶巖等[29]采用熒光測定方法結(jié)果與已知標準菌液濃度復原乳的嗜冷菌平板計數(shù)結(jié)果一致，檢出限低于103CFU/mL，線性范圍為103CFU/mL～108CFU/mL，檢測時間10 h。XIN等[30]優(yōu)化一種用于檢測生牛奶中脂解性熒光假單胞菌的環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)檢測方法，檢測限為7.4×101CFU/反應，可以改善原奶耐熱脂肪酶的影響。

表2 嗜冷菌常見的檢測技術(shù)

3.2 原料乳中嗜冷菌所產(chǎn)胞外酶檢測

為確保乳制品保質(zhì)期，乳制品中蛋白酶活力檢測(表3)至關(guān)重要。馮巖等[39]比較甲醛法、茚三酮法、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法及鄰苯二甲醛(OPA)法檢測堿性蛋白酶水解乳清蛋白的情況，結(jié)果表明甲醛法與茚三酮法所測結(jié)果偏低，不能準確反映乳清分離蛋白水解液中游離氨基濃度；TNBS法和OPA法的靈敏度都很高，尤其OPA法的顯色劑穩(wěn)定性好，精確度高于TNBS法。ZHANG等[40]使用偶氮酪蛋白法測定牛奶中假單胞菌蛋白質(zhì)水解活性，結(jié)果表明蛋白水解活性隨黃油濃度增加而增加，黃油能誘導蛋白水解活性，該方法容易受到乳脂的影響。岳喜慶等[41]也使用該法定量牛乳中蛋白酶活性，檢測限為1 U/mL，具有良好的線性關(guān)系。此外，實驗室常用的GB/T 23527-2009 Folin-酚法，方便簡單，劉晶等[42]使用該方法測定原料乳中蛋白酶活力，通過測定蛋白酶活力來對原料奶品質(zhì)進行分級和評價，結(jié)果表明原料乳中嗜冷菌蛋白酶活性與產(chǎn)品長期保存的品質(zhì)呈負相關(guān)。反向液相色譜(RP-HLPC)則更適用于蛋白酶活力精確定量，MERHEB-DINIC等[43]使用RP-HPLC分析粗酶提取物對酪蛋白組分水解活性，結(jié)果表明其對酪蛋白組分水解作用較低，但該方法耗時較長，樣品較多時不宜適用。

表3 不同酶活力檢測方法的比較

原料乳中脂肪酶活力的檢測同樣重要，BORAN等[44]利用對硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)為底物，用分光光度法定量菌株脂肪酶活性，脂肪酶活性在10.03～22.16 U/mL。瓊脂擴散法適用于細菌脂肪酶菌株的篩選和粗略測定，β-奈酚法適用于不含乳脂肪樣品。江慧芳等[45]比較并改進了滴定法、對硝基苯酚法和銅皂法等三種常用脂肪酶活力測定方法，改進的對硝基苯酚法具有檢測快捷、結(jié)果穩(wěn)定等特點，對銅皂法的改進具有毒性小、結(jié)果穩(wěn)定和重復性好等優(yōu)點。

4 展望

確保乳制品安全加工和延長乳制品保質(zhì)期是乳品企業(yè)控制成本關(guān)鍵因素，但乳品污染是加工生產(chǎn)過程中持續(xù)面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。污染控制措施必須從奶場開始，保證奶場周圍和擠奶設(shè)備環(huán)境清潔、奶牛本身健康性，實時檢測奶牛乳腺炎等疾病。更需嚴格把控原料乳在農(nóng)場到工廠運輸過程的污染，而工廠中好的灌裝和包裝技術(shù)可以限制巴氏殺菌后的污染，在銷售和分銷過程中控制冷藏溫度可以改善，牛奶中嗜冷菌的數(shù)量。

目前原料乳中嗜冷菌、蛋白酶和脂肪酶的檢測，普遍缺乏特異性，需建立具有針對性的方法，要求操作簡單、靈敏度高、成本低廉、結(jié)果具有重復性和精確性，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，這也將是未來乳品行業(yè)需要重點突破的方向。總之，關(guān)于處理原料乳污染檢測技術(shù)及污染治理問題，從奶場到市場對嗜冷菌的控制還需建立一套完整的技術(shù)標準和信息鏈，實時為乳制品安全提供保障。