瘢痕子宮患者外周血T淋巴細(xì)胞Th1/Th2型細(xì)胞因子分泌水平檢測(cè)及意義

安 新， 裴銀輝， 高利常

2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河北 唐山 063000)

剖宮產(chǎn)最初作為解決難產(chǎn)及解除母嬰危險(xiǎn)等狀態(tài)的輔助分娩方式，開始在各級(jí)醫(yī)院開展。但近年來，由于產(chǎn)婦不愿忍受產(chǎn)程疼痛等多方面原因，剖宮產(chǎn)率逐年上升，隨之而來的并發(fā)癥問題也日益顯現(xiàn)，尤其剖宮產(chǎn)術(shù)后發(fā)生的瘢痕子宮影響到再次妊娠[1]。對(duì)瘢痕子宮的發(fā)生機(jī)制目前研究較少，人們對(duì)瘢痕組織中細(xì)胞成分分析表明，瘢痕組織中出現(xiàn)數(shù)量可觀的特異性免疫細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞)、抗原呈遞細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)及中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，而且瘢痕組織的嚴(yán)重程度與創(chuàng)傷部位的淋巴細(xì)胞浸潤有關(guān)，提示瘢痕組織的增殖與機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)系[2]。目前有關(guān)瘢痕子宮的免疫學(xué)發(fā)生機(jī)制尚缺乏深入研究，本研究旨在通過檢測(cè)并分析瘢痕子宮患者外周血T淋巴細(xì)胞分泌Th1/Th2型細(xì)胞因子水平，探討瘢痕子宮的可能免疫學(xué)發(fā)生機(jī)制，從而為瘢痕子宮的免疫學(xué)防治奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇自2017年3月至2019年12月開灤總醫(yī)院產(chǎn)科108例瘢痕子宮剖宮產(chǎn)患者作為瘢痕子宮組，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：分娩方式為剖宮產(chǎn),經(jīng)B超診斷切口愈合為Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)。并排除因子宮肌瘤手術(shù)形成瘢痕的患者。年齡28.9±8.8歲，孕期為39.7±3.6周；同時(shí)，選擇同期收治的126例非瘢痕子宮剖宮產(chǎn)患者作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)為分娩方式為剖宮產(chǎn),經(jīng)B超診斷切口愈合為Ⅰ級(jí)。年齡32.2±6.8歲，孕期為38.8±4.8周。兩組樣本采集時(shí)間均為剖宮產(chǎn)后6個(gè)月。兩組年齡條件一致，資料具有可比性。所有入組產(chǎn)婦均簽署知情同意書。

1.2試劑:淋巴細(xì)胞分離液，邦定泰克生物技術(shù)公司；IFN-γ檢測(cè)試劑盒、IL-12檢測(cè)試劑盒、IL-4檢測(cè)試劑盒及IL-10檢測(cè)試劑盒，晶華生物技術(shù)有限公司；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，GIBCO公司；胎牛血清，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.3方 法

1.3.1外周血T淋巴細(xì)胞分離:無菌采集健康成人外周血，加入預(yù)先滴加250μ/mL肝素鈉的試管中，輕輕混勻后緩慢加入含淋巴細(xì)胞分離液試管中(稀釋血液與淋巴細(xì)胞分離液比例為2∶1)，1500轉(zhuǎn)/分離心15min。將血漿與分離液之間的白膜層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一無菌試管，加5倍體積PBS液，1500轉(zhuǎn)/分離心15min，重復(fù)3次；以含10%胎牛血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞備用。

1.3.2T淋巴細(xì)胞分離百分率測(cè)定:取上述懸浮細(xì)胞涂片，室溫干燥1h會(huì)后甲醛固定。24h后加入鼠抗人CD3單克隆抗體50ul,30min后水洗；干燥后加入羊抗鼠酶標(biāo)記復(fù)合物50μL，30min后水洗，干燥后加入堅(jiān)固紅20μL,1min后水洗，干燥后油鏡計(jì)數(shù)。觀察200個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞膜出現(xiàn)紅色顆粒記為陽性細(xì)胞，以下式計(jì)算T淋巴細(xì)胞分離百分率。T淋巴細(xì)胞百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×100%

1.3.3T淋巴細(xì)胞成活率測(cè)定:取上述懸浮細(xì)胞涂片，干燥后加入臺(tái)盼藍(lán)染液染色1min，沖洗后鏡檢。觀察200個(gè)細(xì)胞，藍(lán)染細(xì)胞為死細(xì)胞，未出現(xiàn)藍(lán)染細(xì)胞記為活細(xì)胞，以下式計(jì)算T淋巴細(xì)胞成活率。T淋巴細(xì)胞成活率=活細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×100%

1.3.4IFN-γ檢測(cè):將懸浮沉淀細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃靜置4h，去除貼壁細(xì)胞。37℃ 5%CO2常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)3d，1000轉(zhuǎn)/分離心15min,取上清備檢。將反應(yīng)孔編號(hào)，加入待檢樣品及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100μL于反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育30min，洗滌；加酶標(biāo)抗體100μL于各反應(yīng)孔中，37℃孵育20min，洗滌；底物液顯色：于反應(yīng)孔中加入TMB底物液100μL，37℃ 10min；于各反應(yīng)孔中加入2M H2S04終止反應(yīng)。于450nm波長下測(cè)各孔OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值求回歸方程，計(jì)算檢測(cè)樣本中IFN-γ濃度。

1.3.5IL-12、IL-4及IL-10檢測(cè)(同1.3.4)。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞分離百分率及成活率比較:瘢痕子宮組及對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞分離百分率及成活率經(jīng)隨機(jī)分組的t檢驗(yàn)，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明本研究中分離的兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞分離百分率及成活率一致，見表1。

表1 不同組別患者外周血T淋巴細(xì)胞分離百分率及成活率比較

2.2兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平比較:t檢驗(yàn)結(jié)果表明，瘢痕子宮患者組外周血中T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ及IL-12水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而瘢痕子宮患者組外周血中T淋巴細(xì)胞分泌IL-4及IL-12水平同對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同組別外周血T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10水平見表2。

表2 不同組別外周血T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ IL-12 IL-4和IL-10水平比較

3 討 論

近年來，我國的剖宮產(chǎn)率呈逐年上升趨勢(shì)，導(dǎo)致瘢痕子宮再次妊娠產(chǎn)婦大幅增加，而瘢痕子宮妊娠可能危機(jī)產(chǎn)婦和胎兒生命，已經(jīng)成為目前產(chǎn)科醫(yī)生面臨的棘手問題[3]。子宮瘢痕的形成后再次妊娠的結(jié)局產(chǎn)生很大影響，嚴(yán)重者可導(dǎo)致子宮破裂[4]。因此，探明瘢痕子宮的易發(fā)因素，有效的預(yù)防瘢痕子宮的形成，減少瘢痕子宮的發(fā)生就顯得尤為重要。臨床醫(yī)療實(shí)踐中，人們觀察到瘢痕子宮的形成和機(jī)體免疫應(yīng)答過程非常相似：初次創(chuàng)傷后瘢痕組織體積較小，發(fā)生慢，類似于初次免疫應(yīng)答的潛伏期。但再次受到損傷后會(huì)瘢痕組織形成速度加快，體積增大,形成瘢痕疙瘩,類似于第二次免疫刺激的再次免疫應(yīng)答過程[5]。剖宮產(chǎn)所產(chǎn)生的物理刺激類似于抗原觸發(fā)的免疫應(yīng)答過程：抗原進(jìn)入機(jī)體，首先被局部的單核-巨噬細(xì)胞或其他輔佐細(xì)胞吞噬和處理，然后以抗原肽與MHC分子復(fù)合物的形式遞呈給Th細(xì)胞,Th細(xì)胞接受協(xié)同刺激后開始活化。活化的Th細(xì)胞向不同方向分化，參與不同的免疫應(yīng)答過程。Th1細(xì)胞通過產(chǎn)生IFN-γ、IL-12、IL-2和IL-3等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫，其中IFN-γ和IL-2是Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[6]。Th2細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10等細(xì)胞因子，參與體液免疫應(yīng)答過程，而IL-4和IL-10是Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[7]。因此，本研究中分別通過測(cè)定病例組和對(duì)照組外周血中淋巴細(xì)胞分泌的決定Th0定向分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，即IFN-γ和IL-2(Th1型細(xì)胞因子)、IL-4和IL-10(Th2型細(xì)胞因子)，分析瘢痕子宮形成與機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)系，推測(cè)其發(fā)生的可能免疫學(xué)機(jī)制。

研究結(jié)果表明：瘢痕子宮組和對(duì)照組外周血中T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平分別為561.12ng/L和318.57ng/L，而兩組IL-12分泌水平分別為16.26ng/L和12.31ng/L，瘢痕子宮組兩種Th1型細(xì)胞因子分泌水平均高于對(duì)照組，差異具有顯著性。瘢痕子宮組和對(duì)照組外周血中T淋巴細(xì)胞分泌IL-4水平分別為5.62ng/L和5.97ng/L，IL-10水平分別為187.32ng/L和208.72ng/L，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均不具有顯著性。提示：瘢痕子宮外周血中T淋巴細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子水平上升。本課題組前期針對(duì)瘢痕子宮的形成與固有免疫關(guān)系研究中的結(jié)果表明，瘢痕子宮患者中性粒細(xì)胞趨化活性上升，但吞噬功能降低。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)瘢痕子宮的形成與機(jī)體Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能異常升高有關(guān)。當(dāng)機(jī)體固有免疫應(yīng)答表現(xiàn)為低能狀態(tài)，受到異物或機(jī)械刺激后，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能的代償性增強(qiáng)，在局部形成以包括多種細(xì)胞聚集為主的炎癥反應(yīng)，刺激成纖維細(xì)胞合成纖維蛋白，促使局部的瘢痕組織增生與形成。