HPLC-MS/MS法鑒別中藥制劑中6種合成色素的方法研究〔1〕

任榮軍，盧大良，李慧敏，歐陽(yáng)毅

(岳陽(yáng)市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 岳陽(yáng) 414000)

藥品生產(chǎn)中色素的使用應(yīng)符合國(guó)家藥品管理部門(mén)的有關(guān)規(guī)定，中藥材和中藥飲片不應(yīng)使用色素[1]。由于利益的驅(qū)使，中藥材的非法染色行為屢禁不止，甚至同時(shí)使用多種色素染色，嚴(yán)重影響中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，也嚴(yán)重危害人民的身體健康。目前，色素的檢測(cè)方法主要有分光光度法、微柱法、極譜法、紫外吸收光譜法、高效液相色譜法、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法等[2]。本文建立了HPLC-MS/MS法快速測(cè)定中藥制劑中6種合成色素，方法快捷、簡(jiǎn)單，專(zhuān)屬性較強(qiáng)，可為檢測(cè)中藥制劑中非法添加色素提供可靠的技術(shù)支撐。報(bào)告如下。

1 儀器與試驗(yàn)藥品

1.1 儀器

Waters 2695e/2489高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器(Waters公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；島津LCMS-8050高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)。

1.2 試驗(yàn)藥品

金橙Ⅱ(111769-201302)、日落黃(510005-201602)、孔雀石綠(520063-201501)、堿性橙Ⅱ(510080-201401)、金胺O(111770-201603)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；亮黃(GRN-966714，美國(guó)進(jìn)口)；黃連上清丸(太極集團(tuán)重慶中藥二廠有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純)；試驗(yàn)用水為超純水；其余化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-packGiss(50mm×2.1mm，1.9 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.02 mol/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～20min，A2%→50%；20～25min，A50%；25～30min，A50%→70%；30～35 min，A 70%)；流速為0.3 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件

電離模式：孔雀石綠采用正離子源電離模式(ESI+)，其余色素均采用負(fù)離子源電離模式(ESI-)，全掃描一級(jí)質(zhì)譜，選擇離子二級(jí)掃描質(zhì)譜檢測(cè)方式；霧化氣：3 L/min，干燥氣：10 L/min，加熱氣：10 L/min，均為高純氮?dú)猓患訜釟鉁兀?00 ℃，加熱塊溫度：400 ℃，脫溶劑管溫度：250 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV。

2.3 溶液的制備

混合對(duì)照試劑溶液的制備：分別取日落黃、金胺O、亮黃、金橙Ⅱ、堿性橙Ⅱ、孔雀石綠對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.05 μg混合對(duì)照試劑溶液，即得。供試品溶液的制備：以黃連上清丸為基質(zhì)，取適量，研細(xì)，取約3.0 g(1次服用量)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，取上述混合對(duì)照試劑濃溶液5 mL，充分吸附后，揮干溶劑，精密加入甲醇25 mL，超聲處理(250 W，40 kHz)15 min，放冷，離心，取上清液以四氟乙烯濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 各化合物標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)信息

精密量取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣，對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，得到各化合物母離子，并對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)掃描得到主要子離子(見(jiàn)圖1和圖2)，并建立各色素標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)信息，同時(shí)取各對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋后測(cè)定，以S/n=3計(jì)算最低檢測(cè)限(見(jiàn)表1)。

圖1 混合對(duì)照品一級(jí)質(zhì)譜

表1 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)信息

2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

黃連上清丸處方中包含有黃連、黃芩、黃柏、大黃等幾味常見(jiàn)黃色染色飲片，以該中成藥作為研究基質(zhì)，考察加入色素混合對(duì)照品溶液后，制劑中其他成分及輔料對(duì)檢測(cè)方法的干擾情況，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)不加混合對(duì)照品溶液制備空白基質(zhì)溶液，比較液相色譜圖與質(zhì)譜圖。結(jié)果顯示，空白基質(zhì)溶液中液相色譜圖沒(méi)有與混合對(duì)照品溶液相同的色譜峰(見(jiàn)圖3和圖4)，而加混合對(duì)照品溶液制備的供試品溶液，均能檢測(cè)到與混合對(duì)照品溶液相同的母離子峰及子離子峰，因此判斷該制劑所含中藥成分及輔料對(duì)結(jié)果無(wú)干擾。

A為金橙Ⅱ，B為堿性橙Ⅱ，C為日落黃，D為金胺O，E為亮黃，F(xiàn)為孔雀石綠；橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比(m/Z)，縱坐標(biāo)為豐度(%)

1為日落黃，2為亮黃，3為金橙Ⅱ，4為金胺O，5為堿性橙Ⅱ，6為孔雀石綠

圖4 樣品色譜圖

2.6 樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)市售的25份中藥制劑進(jìn)行6種合成色素的測(cè)定，結(jié)果均未檢出目標(biāo)分析物。

3 討 論

3.1 測(cè)定方法的選擇

筆者采用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)色素，能有效分離各組分，但部分中藥制劑本身基質(zhì)會(huì)對(duì)色譜峰有不同程度的干擾，影響該方法的通用性。在基質(zhì)有干擾或同時(shí)檢測(cè)更多種色素時(shí)，采用液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，可防止假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠[3]。

3.2 基質(zhì)的選擇

本研究中，在沒(méi)有陽(yáng)性樣品的前提下，基質(zhì)的選擇主要以中藥處方中是否包含有常見(jiàn)的染色飲片為依據(jù)，考慮到方法的通用性，盡量選擇多個(gè)劑型(包括丸劑、片劑和膠囊劑等)作為基質(zhì)。本文選擇黃連上清丸作為基質(zhì)，處方中包含有黃連、黃芩、黃柏、大黃等幾味常見(jiàn)染色品種，且均以原粉入藥，基本符合試驗(yàn)的要求。合成色素為弱酸性化合物時(shí)，適合于負(fù)離子掃描模式[4]，偏堿性色素則宜采用正離子掃描模式。本文中孔雀石綠為弱堿性化合物，在負(fù)離子掃描模式下檢測(cè)不到準(zhǔn)分子離子峰，選擇正離子掃描模式，在不接色譜柱的條件下進(jìn)行母離子全掃描，確定了準(zhǔn)分子離子峰。本文建立了6種色素的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，得到了標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)信息，數(shù)據(jù)庫(kù)的使用達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，降低了試驗(yàn)成本，尤其適用于大數(shù)量檢品的快速篩查，為打擊中成藥中非法添加色素的制假摻偽行為提供了一定技術(shù)支撐。