血漿lncRNA ANRIL水平在高血壓患者腦動脈硬化中的臨床意義

王翀 朱曉蕾 黃嶸 王曉云

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院神經內科，江蘇 南京 210008)

隨著生活和飲食習慣的改變，我國高血壓(high blood pressure，HBP)患者日益增多[1]。臨床統計數據顯示，HBP是多種心腦血管病的病理基礎和危險因素，長期高血壓可引起動脈硬化，如動脈血管增厚、血管腔狹窄、血管變硬或形成斑塊等[2-3]。腦動脈硬化(cerebral arteriosclerosis，CAS)是動脈硬化的一種，可能會導致記憶減退、腦出血、腦梗死、偏癱甚至神經退行性疾病等[4-5]。因此，有效預防或早期診斷CAS具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA ANRIL (Long non-coding RNA ANRIL，lncRNA ANRIL)是長度為 3.8 kb的lncRNA家族成員[6-7]。研究顯示，lncRNA ANRIL與冠心病、顱內動脈瘤、2型糖尿病及多種惡性腫瘤密切相關[8-9]。但目前lncRNA ANRIL是否與HBP患者發生CAS有關還不清楚。本研究通過對比分析血漿lncRNA ANRIL在HBP和HBP/CAS之間的差異，探討其可能的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月～2019年12月在我院就診的HBP患者218例，其中合并CAS者89例作為高血壓合并腦動脈硬化組(HBP/CAS)，未合并CAS患者129例作為高血壓組(HBP)。高血壓診斷標準：兩次血壓檢測均值均收縮壓≥140mmHg或舒張壓≥90mmHg的患者。腦動脈硬化診斷標準：經病史癥狀、相關血生化指標；腦部血管彩超；經顱多普勒超聲；CTA、MRA或DSA檢查等確診。根據病史和檢驗結果排除糖尿病、冠心病、肝腎功能不全、周圍血管性疾病、高脂血癥、急慢性感染性疾、系統性免疫功能疾病及惡性腫瘤等。本研究通過了醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 血生化儀由深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司提供；GenEluteTM血漿/血清RNA提取試劑盒由德國默克公司提供；lncRNA-ANRIL RT-qPCR檢測試劑盒由大連Takara Bio公司提供。

1.3 方法

1.3.1 臨床參數測量統計 統計所有患者臨床資料，記錄患者收縮壓和舒張壓、性別、年齡、身高、體重、腰圍、臀圍，計算腰臀比和體重指數。

1.3.2 生化指標檢測 檢測前一晚9點后禁水禁食，次日清晨抽取靜脈血，血生化儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、血糖(GLU)及同型半胱氨酸(Hcy)濃度。

1.3.3 RT-qPCR檢測各組患者血漿lncRNA ANRIL水平 采用GenEluteTM血漿/血清RNA提取試劑盒提取RNA。用lncRNA ANRILRT-qPCR檢測試劑盒制備檢測樣品。以ABI 7500熒光定量PCR儀器 (美國Applied Biosystems)進行檢測。以U6作為內參，經95℃/30秒，90℃/5秒，65℃/30秒40個循環得到最終數據，以2(-ΔΔCT)法計算lncRNA ANRIL水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS 15.0軟件行統計學分析，數據經K-S檢驗進行正態性和方差齊性檢驗，數據符合正態分布并以2表示，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用2檢驗。Pearson法分析各變量間的相關性，單因素和多因素Logistic回歸分析發生HBP/CAS的危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBP和HBP/CAS組患者人體臨床參數比較 HBP/CAS組和HBP組患者性別、BMI、腰臀比及血壓均無差異(P>0.05)；而相較于HBP組，HBP/CAS組患者年齡明顯偏高(P<0.01)，見表1。

表1 HBP組和HBP/CAS組患者人體臨床參數比較Table 1 Comparison of human clinical parameters between HBP group and HBP/CAS group

2.2 HBP和HBP/CAS組患者各生化指標比較 生化指標檢測結果顯示，與HBP相比，HBP/CAS組TC、TG、LDL-C、GLU和Hcy顯著生高，HDL-C明顯降低(P<0.05)。

2.3 HBP和HBP/CAS組患者血漿lncRNA ANRIL水平比較 RT-qPCR檢測HBP和HBP/CAS組患者血漿lncRNA ANRIL水平，結果顯示，相較于HBP組HBP/CAS組患者血漿lncRNA ANRIL水平明顯升高(P<0.01)，見表2、圖1。

表2 HBP和HBP/CAS組患者各生化指標比較Table 2 Comparison of biochemical indexes of patients in HBP and HBP/CAS groups

圖1 HBP和HBP/CAS組患者血漿lncRNA-ANRIL水平比較Figure 1 Comparison of plasma lncRNA-ANRIL levels between HBP and HBP/CAS groups注：①P<0.01

2.4 HBP/CAS的危險因素分析 以年齡、TC、TG、LDL-C、HDL-C、GLU、Hcy作為自變量，以HBP是否合并CAS為因變量，單因素logistic回歸分析結果顯示，年齡、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Hcy及lncRNA ANRIL與HBP/CAS的發生有關(P<0.05)；而通過多因素logistic回歸進行分析，結果顯示年齡、TC、TG、Hcy及lncRNA ANRIL是引起HBP/CAS發生的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 HBP/CAS的危險因素分析Table 3 Analysis of risk factors of HBP/CAS

2.5 HBP/CAS患者血漿lncRNA ANRIL水平與年齡、TC、TG、Hcy的相關性分析 采用Pearson法分析lncRNA ANRIL與年齡、TC、TG、Hcy的相關性，結果顯示，lncRNA ANRIL與TC(r=0.7369，P<0.001)和TG(r=0.8013，P<0.001)呈強正相關，與年齡和Hcy不相關(P>0.05)，見圖2。

圖2 HBP/CAS患者血漿lncRNA ANRIL水平與年齡、TC、TG、Hcy的相關性Figure 2 The correlation of plasma lncRNA ANRIL levels with age,TC,TG,Hcy in HBP/CAS patients

3 討論

LncRNA ANRIL是LncRNA大家族的一員，在惡性腫瘤和代謝性疾病中發揮一定作用。在癌細胞中，過表達LncRNA ANRIL可增加細胞增殖、存活、上皮間質轉化和轉移，而ANRIL功能的喪失會導致細胞產生相反的惡性生物學行為[8-11]。在代謝疾病中，LncRNA ANRIL與2型糖尿病、冠心病、腦梗塞等有關[12-14]。研究顯示，LncRNA ANRIL可通過調節自噬途徑中的microRNA-99a和microRNA-449a促進血管生成和血栓形成[15]。同時，LncRNA ANRIL與炎癥存在聯系，LncRNA ANRIL/miR-125a信號軸可作為潛在的生物標志物用于評估支氣管哮喘的炎癥水平和疾病嚴重程度[16]。Hu等[17]報道，LncRNA ANRIL通過miR-122-5p/BRCC3信號軸促進尿酸腎病中NLRP3炎癥小體的激活。此外，研究還發現LncRNA ANRIL與平滑肌細胞衰老密切相關[18]。目前，還未有臨床研究報道lncRNA ANRIL是否與HBP患者發生CAS有關。

本研究通過分析HBP和HBP/CAS組患者人體臨床參數發現，兩組患者在性別、BMI、腰臀比及血壓上均無顯著性差異，而HBP/CAS組患者的年齡明顯偏高。血生化指標分析顯示，HBP/CAS和HBP組患者血清TC、TG、LDL-C、GLU和Hcy水平存在明顯差異。同時，LncRNA ANRIL在HBP/CAS組患者血漿中表達升高。為了分析上述差異指標與HBP/CAS發生的相關性，本研究通過logistic回歸進行分析發現年齡、TC、TG、Hcy及lncRNA ANRIL是引起HBP發生CAS的獨立危險因素。有研究證實，在老年HBP人群中Hcy是影響頸動脈硬化的危險因素[19-20]。還有研究顯示，血清TC和TG是HBP患者頸動脈硬化及斑塊形成的危險因素[21-22]。這些與本研究TC、TG和Hcy的分析結果相類似。LncRNA ANRIL與年齡、TC、TG和Hcy均為HBP發生CAS的獨立危險因素。本研究進一步觀察了LncRNA ANRIL與TC、TG和Hcy的相關性，結果發現lncRNA ANRIL與TC和TG呈強正相關。研究報道，巴基斯坦北部人群的LncRNA ANRIL單核苷酸多態性與家族性高膽固醇血癥密切相關[23]。提示HBP患者血漿LncRNA ANRIL水平增加可能導致或標志血清TC和TG水平升高，最終增加CAS發生的風險。

4 結論與啟示

血漿lncRNA ANRIL水平升高是HBP患者發生CAS的獨立危險因素，而lncRNA ANRIL水平與TC和TG相關。lncRNA最初被認為是轉錄過程的副產物，不具有生物學功能。但近年來，越來越多的lncRNA被發現與多種疾病發生發展相關，甚至可以作為早期診斷標志物。因此，深入了解lncRNA家族成員的生物學功能具有重要意義。本研究發現血液中lncRNA ANRIL水平與TC和TG相關，但其具體關聯機制還不清楚，有待于進一步實驗探討。