激動髓樣細胞-2觸發受體減輕圍術期神經認知障礙*

田芳芳 呼芳芳 趙靜 王寧 馬磊

(1.西安交通大學第二附屬醫院麻醉科，陜西 西安 710004；2.空軍軍醫大學第二附屬醫院，陜西 西安 710038)

圍術期神經認知障礙(Perioperative neurocognitive disorders，PND)是指與術前相比,術后短期及長期學習、記憶和神經心理學測試等執行功能下降的一種臨床綜合征[1-2]。當前眾多研究表明PND是重大手術后的重要并發癥[3-4]，其與不良結局密切相關[5-7]。但是，PND的發病機制仍然不明。有證據表明，外科創傷引起的炎癥在PND的發生中起關鍵作用[8-9],且炎癥因子的高低與血漿和海馬組織中細胞因子水平的升高相平行，阻斷炎癥能夠減少記憶障礙[10-14]。髓樣細胞2-觸發受體(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是TREM家族的免疫球蛋白樣受體，目前相關研究認為細胞高表達TREM2在免疫監視、細胞間相互作用和抑制潛在的炎癥反應中起重要作用[15-17]。相反，當細胞中缺乏TREM2則會增加促炎性細胞因子產生[18]。因此，TREM2被認為是神經炎癥的重要負性調節劑。但是，當前還缺少TREM2在外科手術中參與調節神經炎癥和認知功能的研究。本研究探討在骨科手術后，小鼠海馬中TREM2和促炎因子的表達情況，并探究改變TREM2表達是否可以改變小鼠的神經炎癥以及學習和記憶障礙。

1 實驗和方法

1.1 實驗動物 動物實驗已獲得西安交通大學(中國西安)動物實驗倫理委員會的批準，并按照其動物實驗指南進行。雄性野生型C57BL/6小鼠購自西安交通大學實驗動物中心。在藥物干預或手術之前，將小鼠(4個月大)適應性飼養至少一周，光照/黑暗周期為12小時，溫度為21±2℃，濕度為60%～70%。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗方案 實驗第一部分：驗證模型的成功及術后激動髓樣細胞-2 (TREM2)的表達，將20只雄性野生型C57BL/6小鼠隨機分為對照組和手術組兩組，每組各10只，對照組小鼠僅給予異氟烷麻醉，麻醉時間與手術組小鼠相同；手術組小鼠在異氟烷麻醉下接受脛骨骨折髓內固定術。在手術前24小時對小鼠進行恐懼條件訓練，恐懼條件測試(Fear conditioning test,FCT)分別在術后1、3和7天進行,并采用曠場實驗評估小鼠的運動能力。在最后一次行為評估后，將動物處死進行western blot檢測TREM2的表達。(為排除異氟烷的干擾，本研究對對照組和手術組均進行了異氟烷麻醉處理，麻醉時間相同)。實驗第二部分：將40只小鼠隨機分為對照組、手術組、HSP60+手術組和TREM2-siRNA+HSP60+手術組4組，每組各10只。對照組小鼠僅給予異氟烷麻醉，麻醉時間與手術組小鼠相同；手術組小鼠在異氟烷麻醉下接受脛骨骨折髓內固定術。手術前30分鐘將TREM2-siRNA立體定向注射入側腦室，方法按照我們先前實驗，可使用亞甲藍檢測注射效率[19]。將選擇性TREM2受體激動劑熱休克蛋白60(HSP60)在麻醉蘇醒后立即腹腔注射(5μg/小鼠)，按前述方法每24小時注射一次，連續7天，在手術前24小時對小鼠進行恐懼條件訓練。FCT分別在術后1、3和7天進行,并采用曠場實驗評估小鼠的運動能力。在最后一次行為評估后，一半小鼠(n=5)用于Western blot和ELISA分析，另一半(n=5)用于免疫熒光檢測，見圖1。

圖1 實驗流程圖Figure 1 Experimental protocol

1.2.2 手術模型 采用文獻報道方法[20],小鼠在異氟烷麻醉下接受了脛骨骨折髓內固定術，在膝蓋以下切開皮膚，暴露脛骨，將0.3毫米針頭插入髓腔以實施髓內固定，然后于中點斷裂脛骨，消毒并縫合切口。手術持續約10分鐘，總麻醉時間約20分鐘。在手術過程中，使用加熱墊將小鼠的直腸溫度維持在(37±0.5)℃。麻醉后，將小鼠于加熱毯保持體溫直至完全蘇醒，返回飼養籠。為了減輕皮膚切口的疼痛，在切口處局部使用2%利多卡因溶液浸潤麻醉，并且于手術后在傷口中每天兩次施用1%鹽酸丁卡因凝膠3天。

1.2.3 曠場實驗 在恐懼條件訓練和測試前15分鐘進行了曠場測試。于昏暗燈光下，將每只小鼠輕輕放在曠場的中心，讓其自由移動5分鐘。通過自動分析系統自動記錄運動過程。通過總的探索距離來測量小鼠的運動能力。在每次測試后，用75%的乙醇洗滌測試場地，以避免出現嗅覺提示。

1.2.4 條件性恐懼測試 采用文獻報道方法[20]，進行條件性恐懼測試過程，包括術前訓練以及術后1、3和7天的測試。簡而言之，在手術前一天，對小鼠進行條件性恐懼訓練以建立長期記憶。在測試階段，僅將小鼠放在測試室中5分鐘，不要用腳踩電擊。記錄潛伏期百分比(定義為小鼠不活動但呼吸的時間)。

1.2.5 小干擾RNA轉染 對C57BL/6小鼠體內進行了小干擾RNA(siRNA)體內轉染。簡而言之，立體定位坐標為前囟部后0.4 mm，中線外側1.0 mm，顱骨表面下方2.5 mm，將不銹鋼套筒植入側腦室。根據制造商說明書，在手術前30分鐘，分別將2μL TREM2-siRNA的稀釋混合物立體定位注射到側腦室。

1.2.6 蛋白印跡分析(Western Blotting) 處理后收集小鼠的海馬組織蛋白，并如先前所述進行蛋白質印跡分析[22]。使用了抗TREM2兔抗體(1∶200)和辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔二抗(1∶10000)。通過化學發光技術檢測抗原。圖像分析通過Image J軟件進行。

1.2.7 實時定量PCR 使用RNeasy試劑盒(美國QIAGEN)從冷凍海馬組織中提取RNA，而高容量cDNA逆轉錄試劑盒(美國Life Technologies)用于反轉錄。使用ABI Prizm 7500熱循環儀，使用TaqMan引物(美國Life Technologies)和TaqMan Universal PCR Master Mix(美國Life Technologies)進行實時PCR，以GAPDH為參照，用2ΔΔCt法比較TREM2基因的表達水平[23]。

1.2.8 酶聯免疫吸附測定 根據ELISA試劑盒方案，將海馬樣品在PBS中制備組織勻漿，離心(10,000 rpm，5分鐘)，收集上清液用于ELISA檢測。使用96孔板在450nm處測量吸光度，并測量白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)，腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達。

2 結果

2.1 手術誘發小鼠PND的發生，并降低海馬中TREM2的表達 首先，我們探討了異氟烷麻醉下的手術是否可以誘發PND的發生以及術后海馬組織中TREM2的表達變化。分別在手術后1、3和7天FCT前15分鐘評估手術對運動能力的影響，通過在曠場內5分鐘內的總移動距離以評估運動能力。各組小鼠基線運動能力差異無統計學意義，表示小鼠的運動能力不受手術影響，見圖2A～D。進行FCT的情境測試，以評估海馬依賴性記憶。與對照組相比，手術組小鼠術后1、3和7天的凍結時間均減少(P<0.05)，見圖2E-G。Western blot結果顯示：手術組小鼠海馬區TREM2表達下降，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2H-I。

圖2 手術對小鼠運動能力及學習記憶能力的影響Figure 2 The effect of surgery on the movement,learning and memory ability in mice注：A-D.曠場實驗小鼠運動總距離；E-G.條件性恐懼測試中術后1、3和7天凍結時間百分比統計圖；H-I.Western blot檢測海馬中TREM2的表達及統計結果(①P<0.05 表示與對照組相比差異有統計學意義，n=10)

2.2 選擇性TREM2受體激動劑HSP60降低了手術后PND的發生率，但是側腦室內注射TREM2-siRNA消除了HSP60對小鼠的作用 分別在手術后1、3和7天FCT前15分鐘，評估手術和藥物治療對運動能力的影響。各組小鼠基線運動能力差異無統計學意義，表示運動能力不受手術和藥物治療的影響，見圖3A-D。進行FCT的情境測試以評估海馬依賴性記憶。與對照組相比，手術后1、3和7天小鼠凍結時間均顯著減少(P<0.05)，見圖3E-G。與手術組相比，HSP60治療組在手術后三個時間點凍結時間明顯增加(P<0.05)，使用TREM2-siRNA可以顯著消除HSP60誘導的效應(P<0.05)。

圖3 上調TREM2對小鼠運動能力以及依賴性記憶的影響Figure 3 The effect of TREM2 up-regulation on the movement and dependent memory of mice注：A-D.曠場實驗小鼠運動總距離；E-G.條件性恐懼測試中術后1、3和7天凝固時間百分比統計圖(①P<0.05為對照組vs手術組差異有統計學意義，②P<0.05為手術組vsHSP60+手術組差異有統計學意義，③P<0.05為HSP60+手術組vsTREM2-siRNA+HSP60+手術組差異有統計學意義n=10)

2.3 HSP60增加手術后海馬組織中TREM2的表達，而側腦室內注射TREM2-siRNA可逆轉HSP60對小鼠的影響 手術誘導海馬組織TREM2表達降低。HSP60治療減輕了手術引起的TREM2下調，而TREM2-siRNA逆轉了HSP60的作用。Western blot與實時定量PCR分析結果顯示，與對照組相比，術后7天手術組小鼠海馬組織中TREM2表達顯著降低(P<0.05)。與手術組相比，HSP60治療在術后7天導致TREM2表達增加(P<0.05)，而給予TREM2-siRNA逆轉了上述HSP60的作用(P<0.05)，見圖4。

圖4 HSP60對小鼠海馬組織中TREM2表達的影響Figure 4 The effect of HSP60 on TREM2 expression in mouse hippocampus注：A-B.Western blot檢測海馬中TREM2的表達及統計結果；C.實時定量PCR分析TREM2的表達(①P<0.05為對照組vs手術組差異有統計學意義，②P<0.05為手術組vs HSP60+手術組差異有統計學意義，③P<0.05為HSP60+手術組vs TREM2-siRNA+HSP60+手術組，差異有統計學意義，n=5)

2.4 HSP60減少手術后促炎因子釋放并增加抗炎和神經營養因子釋放，且腦室內注射TREM2-siRNA可以消除HSP60對小鼠的影響 與對照組相比，手術后7天手術組小鼠海馬組織中TNF-α，IL-1β和IL-6水平明顯升高(P<0.05)，HSP60處理降低了TNF-α，IL-1β和IL-6的水平(P<0.05)，給予TREM2-siRNA可以逆轉HSP60效應(P<0.05)。以上結果表明，HSP60誘導的TREM2表達增加可以降低手術后腦組織的炎癥反應，見圖5。

圖5 上調TREM2對小鼠腦炎性因子的影響Figure 5 The effects of TREM2 up-regulation on inflammatory factors in mice注：A-C.ELISA檢測海馬中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達及統計結果(①P<0.05為對照組vs手術組差異有統計學意義，②P<0.05為手術組vs HSP60+手術組差異有統計學意義，③P<0.05為HSP60+手術組vs TREM2-siRNA+HSP60+手術組差異有統計學意義，n=5)

3 討論

本實驗的目的是探究異氟烷麻醉下接受脛骨骨折髓內固定術的成年小鼠的圍術期神經認知障礙、神經炎癥和TREM2表達之間的關系。據我們所知，這是第一次探索TREM2對接受外科手術小鼠學習和記憶的影響。此外，本實驗探究了TREM2激動劑HSP60對其上調和TREM2-siRNA對其下調對手術小鼠學習和記憶的影響，并評估了與記憶功能密切相關的小鼠海馬組織中的炎癥反應。結果表明，手術后小鼠海馬依賴性記憶受損，術后HSP60干預減輕了手術引起的記憶障礙，減少了促炎因子的釋放，而TREM2-siRNA逆轉了上述HSP60誘導的有益作用。

研究表明，異氟烷麻醉下手術可能會引起神經炎癥，在小鼠中誘發PND，并損害海馬依賴性學習和記憶功能。本研究通過條件性恐懼測試檢測海馬功能[20-21]。神經炎癥與認知障礙有關，是PND的主要發病機制[21]。此外促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，已被廣泛研究為與認知障礙相關的神經炎癥介質[21-22]。在本研究中，觀察到手術后海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，從而導致記憶障礙，這與文獻報道結果是一致的，表明神經炎癥和術后認知障礙同時發生。此外毫無疑問，異氟烷對小鼠認知功能障礙具有一定的影響[23]，因此在本研究中，為最大的降低麻醉藥物帶來的負面效應，我們對對照組和手術組均進行了異氟烷的麻醉，以盡可能的保證實驗結果的可靠性。

TREM家族受體僅在髓樣細胞上被檢測到，并認為與先天免疫反應有關[24]。TREM2基因位于小鼠染色體17C上[25]，在大腦中，TREM2在小膠質細胞中高度表達，最近發現是阿爾茨海默癥的危險基因[26-28]。TREM2還通過調節炎性因子的釋放來調節周圍組織的炎性過程[29]。TREM2缺乏在實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中引起不受控制的炎癥[18]。因此，TREM2在神經炎癥的負調控中起關鍵作用[30]。在本研究中，我們還發現手術并沒有損害小鼠的運動能力，各組小鼠間的總運動距離間差異無統計學意義。另外，手術后TREM2表達降低，但通過使用選擇性TREM2激動劑HSP60后，小鼠海馬組織中TREM2的表達顯著增加，從而改善了學習和記憶功能，減輕了小鼠的神經炎癥。但是，TREM2-siRNA消除了HSP60誘導的TREM2表達的增加，并逆轉了HSP60誘導的對學習和記憶功能的改善以及對大腦炎癥的減輕作用。因此，TREM2的上調可能與減輕神經炎癥以及改善學習和記憶功能有關，并最終減少PND的發生。

本研究仍然存在一些局限性。首先，我們的研究強調了小鼠海馬組織中由手術引起的神經炎癥，但沒有評估全身性炎癥。其次，在這項研究中，我們僅使用siRNA下調TREM2表達，在未來的工作中我們將使用基因敲除小鼠來驗證我們的發現。

4 結論與啟示

本研究表明TREM2的表達增加對PND具有潛在的保護作用。選擇性TREM2激動劑HSP60的治療可減輕神經炎癥，并改善術后的學習和記憶功能，給予TREM2-siRNA可逆轉HSP60的有益作用。本文研究結果表明，TREM2可能是PND治療的潛在新靶點。