杜馬斯燃燒定氮法和凱氏定氮法在蔬菜粗蛋白質含量檢測中的比較

常 碩 張延國 劉廣洋 許曉敏 黃曉冬 呂 軍 徐東輝

〔中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業農村部蔬菜質量安全控制重點實驗室，農業農村部蔬菜產品質量安全風險評估實驗室（北京），北京100081〕

粗蛋白質含量是評價食品品質的重要指標之一，選擇一種優良的檢測手段能更好地對食品品質作出準確、快速的評價。多年來人們不斷創新與改進，建立了多種蛋白質檢測方法，目前在國際上被廣泛認可的檢測方法主要有兩種：凱氏定氮法（凱氏法）和杜馬斯燃燒定氮法（杜馬斯法）。凱氏法占據粗蛋白質分析領域的主導地位已經有100 多年，圍繞其建立的各類食品中氮-蛋白質換算系數理論更是被譽為經典，能夠快速高效地檢出能被濃硫酸消解轉化的銨態氮（有效消解蛋白質，卻無法轉化樣品中的硝酸鹽），經過蛋白質折算系數換算后，可以得到幾近真值的結果（楊瑤 等，2018）。實際上這個結果是否代表了真正的蛋白質含量已不重要，重要的是凱氏法在貿易和科研等領域中起到的檢測標桿作用，其操作簡單、設備成本相對較低，直到今天仍被幾乎所有國家和組織所認可。相對于凱氏法，杜馬斯法則是在國際日趨嚴格的安全與環保要求下被重新重視的方法，該理論的提出甚至比凱氏法還早了50 多年，但當時的工業生產和技術水平限制了其發展。杜馬斯法對樣品采取高溫通氧燃燒的方式，可將其中全部的氮素充分轉化后定量，并同樣使用凱氏蛋白質折算系數進行換算，因此檢測結果更接近樣品真實的總氮含量（梁世岳 等，2016；王鐵良 等，2019）。

目前，采用杜馬斯燃燒定氮原理的儀器設備和技術已日趨完善，在國際社會應用非常廣泛，且該方法早已被美國、歐盟等很多國家和國際組織所認可（樊霞 等，2014；秦琳 等，2019），表1 列出了對杜馬斯法認可的國家和組織及其所制定的標準。目前我國也將杜馬斯法列為食品蛋白質檢測的國標方法（GB 5009.5—2016），但在國內蔬菜檢測領域的應用比例卻不高，具備相關參考價值的文章并不多，因此有必要對凱氏法和杜馬斯法進行驗證和研究分析。本試驗選擇15 種常見蔬菜作為樣品，分別采用凱氏法和杜馬斯法進行粗蛋白質含量檢測，通過對數據結果的研究分析，對兩種檢測方法進行比較，以期為蔬菜粗蛋白質檢測方法的選擇提供可靠的數據支撐和研究參考。

表1 一些國際組織出臺的基于杜馬斯燃燒定氮法的方法標準

1 材料與方法

1.1 樣品采集和制備

樣品采集：選取市場較常見的15種新鮮蔬菜，包括大白菜、普通白菜、青花菜、菠菜、番茄、辣椒、山藥、馬鈴薯、姜、黃瓜、豌豆、蘿卜、大蒜、豌豆苗、香菇。對于散裝成堆樣品采用分層采樣，對于包裝樣品采用堆垛采樣，每種樣品采集量不少于3.5 kg。當單個個體大于0.5 kg 時，選擇不少于10 個個體；單個個體大于1 kg 時，選擇不少于5個個體。去除附著的泥土、腐爛和萎蔫莖葉，待用（NY/T 789—2004）。

縮分：取樣本可食用部分（去除果柄、葉菜根部等），于清潔的聚乙烯塑料薄膜上，將其切碎并充分混勻，放入食品加工機中打碎成勻漿，取500 g 左右待用，其余勻漿倒入分裝容器中，于-20 ℃冰箱中保存（NY/T 762—2004）。

干樣制備：將勻漿倒入平鋪有聚乙烯塑料薄膜的白搪瓷盤中，置于鼓風干燥箱中105 ℃加熱15min 滅酶活，然后在60～70 ℃條件下干燥24～48 h，使用粉碎機粉碎，使全部樣品通過40目篩，混合均勻后放置于干燥器內，待測。勻漿按GB 5009.3—2016 方法測定水分含量，用于鮮樣粗蛋白質的換算。

1.2 主要設備

FOSS 2300 半自動凱氏定氮儀和配套20 位樣品消化爐（丹麥FOSS 公司）；rapid N exceed 杜馬斯定氮儀（德國Elementar公司），氣體CO2（99.99%）和O2（99.99%）。

1.3 主要試劑

硼酸、濃硫酸、氫氧化鉀（均為分析純），鹽酸標準滴定溶液（北京鋼研納克公司，0.100 0 mol·L-1），硫酸銨溶液〔中國醫藥（集團）上海化學試劑公司，氮含量1 mg·mL-1〕，D-天冬氨酸（Sigma公司，99%），凱氏催化劑片（丹麥FOSS 公司）。

1.4 檢測方法

1.4.1 凱氏定氮法 樣品檢測：稱取0.2～0.5 g（準確至0.001 g）蔬菜樣品（依干基試樣蛋白質含量適當增減，每種蔬菜平行稱取6 份）于6 支消化管中，每支加入1 片凱氏催化劑片和8 mL 濃硫酸，置于消化爐上420 ℃消解2 h，待消解完全呈藍綠色透明溶液后取下冷卻至室溫，使用凱氏定氮儀檢測，記錄蛋白質百分含量。

回收率試驗：用移液器分別移取0.5、1、2、5、10 mL 硫酸銨溶液至消化管中，每個梯度做3 個平行，每支中加入1 片凱氏催化劑片和8 mL 濃硫酸，置于消化爐上420 ℃消解2 h，待消解完全呈藍綠色透明溶液后取下冷卻至室溫，使用凱氏定氮儀檢測，記錄氮百分含量，計算回收率。

1.4.2 杜馬斯燃燒定氮法 稱取0.1～0.2 g（準確至0.001 g）樣品于錫箔紙中，包裹密封樣品后，通過手工沖壓器擠出樣品中空氣，壓緊包裝樣品，放置在自動進樣器上待測。樣品在935 ℃高溫的燃燒管中加氧燃燒分解氣化，形成混合氣，在CO2載氣推動下，干擾氣體被吸收管、干燥管吸收，氮氧化物被全部還原為N2，最終通過熱導檢測器（TCD）檢測，記錄蛋白質百分含量。

回收率試驗：稱取0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 g（準確至0.001 g）天冬氨酸高純物質于錫箔紙中，每個梯度做3 個平行，包裹密封樣品后，通過手工沖壓器擠出樣品中空氣，壓緊包裝樣品，放置在自動進樣器上待測，記錄氮百分含量，計算回收率。

1.5 數據分析

對兩種檢測方法的參數進行比較；將檢測結果按方法分成兩組，進行線性回歸擬合、CV、回收率和精密度分析；采用SPSS 軟件對結果進行單因素ANOVA 方差分析，選擇95%置信度作為統計學顯著性檢驗的標準，并進一步對硝酸鹽含量和結果差異性之間是否存在關聯進行分析。

2 結果與分析

2.1 方法比較

表2 列出了凱氏法和杜馬斯法的部分項目比較。首先，在試劑耗材和廢棄物方面，凱氏法需要大量強酸、強堿等有害試劑，且需要高溫強酸消解，易對人員健康及環境安全造成較大影響，在如今提倡全產業鏈可持續發展的大背景下，確實是不可取的。杜馬斯法所使用的氧化催化劑（CuO、Pt）、吸附劑、還原劑（W）、干燥劑、錫箔紙包材以及CO2、O2氣體，均是低毒、環保型試劑耗材，且試驗產生的廢棄物僅有N2、CO2等氣體以及燃燒后的廢渣，同樣是安全無害的。其次，結合主要能耗設備的額定功率及使用時間估算能耗，凱氏法的消解和檢測設備共耗電約58 kW·h，而杜馬斯法設備僅耗電約22 kW·h，耗電量不到凱氏法的一半。最后，凱氏法的檢測環節需要人員值守，并會積攢大量需要清洗的消化管，而杜馬斯法的檢測環節無人值守，且無需洗刷試驗器皿，僅每進150個樣品清理燃燒管廢渣即可。由以上比較可以看出，杜馬斯法相比凱氏法在安全、環保、能耗、工作效率和勞動強度方面具有非常明顯的優勢，尤其是當樣品量較大時，采用杜馬斯法能夠大量釋放人力資源，并在減少試驗時間的同時，有效降低檢測人員的勞動強度（Sader et al.，2004；黃遠麗 等，2019）。

2.2 線性回歸分析

采用杜馬斯法和凱氏法對15 種蔬菜中粗蛋白質含量進行檢測。以杜馬斯法結果均值為橫坐標，凱氏法結果均值為縱坐標，利用WPS 表格工具，按蔬菜種類擬合線性回歸曲線（張秀蓮 等，2015），回歸方程：y=0.999 6x-0.032，R2=0.999 7，見圖1。

從圖1 中可以看出，杜馬斯法測定的粗蛋白質含量范圍在0.88%～7.42%，凱氏法在0.87%～7.38%之間，其中以粗蛋白質含量在1%～3%的蔬菜種類最多。兩種方法的檢測結果非常接近（D/K 范圍1.00～1.08），呈顯著線性相關（R2=0.999 7），說明檢測結果趨向一致（表3）。

2.3 精密度和回收率分析

由表3 可見，杜馬斯法CV在0.3%～2.1%之間，回收率在98.1%～101.9%之間；凱氏法CV在0.3%～1.4%之間，回收率在98.7%～99.8%之間。參考了實驗室質量控制規范的技術要求（GB/T 27404—2008）后得出，兩種方法均滿足實驗室質量控制規范對CV和回收率指標的技術確認要求（表4）。盡管每種蔬菜的D 值均不小于K 值（D/K 范圍1.00～1.08），但兩種方法間重復性條件下得到的獨立測定結果D、K 間的精密度RSD 在0.4%～8.1% 之間，滿足國標GB 5009.5—2016 的要求（RSD ＜10%），說明兩種方法間的重現性良好，檢測結果準確度高。

表4 檢測方法確認的回收率和變異系數技術要求

2.4 方差分析

依據表3 中單因素方差分析結果可以看出：15 種蔬菜中有12 種的檢測結果間不存在顯著差異（P＞0.05），僅大白菜、普通白菜和菠菜的檢測結果間存在顯著差異（P＜0.05）。這種差異可能是由于蔬菜中硝態氮（硝酸鹽）含量較高造成的（Waston &Galliher，2001）；郭望山和孟慶翔（2006）也得到一致的結果，同時他們還指出，在大部分低硝酸鹽含量的植物源性蛋白質飼料中，兩種方法的檢測結果之間并不存在顯著差異（P＞0.05）。本試驗采用離子色譜檢測了15 種蔬菜的硝酸鹽含量后發現，結果差異最顯著的3 種蔬菜均具有較高的硝酸鹽含量水平，說明高水平硝酸鹽含量的確是造成兩種檢測結果差異顯著的原因，但硝酸鹽含量與D-K 差值之間的線性關系并不顯著（R2=0.718 7），見圖2。除了大白菜外，具有高硝酸鹽含量的菠菜并不具有相應更高的D-K（圖中圓形區域），而硝酸鹽含量最低的蔬菜反而具有較大的D-K（圖中矩形區域）；另外，5 種高硝酸鹽含量蔬菜（大白菜、普通白菜、菠菜、蘿卜、山藥）粗蛋白質含量的F值與硝酸鹽含量之間呈低度線性相關（R2=0.329 4），見圖3，說明硝態氮含量的高低并不是造成凱氏法和杜馬斯法的粗蛋白質檢測結果差異顯著的唯一原因（郭曉旭 等，2008）。

表3 采用杜馬斯法和凱氏法檢測15 種蔬菜中粗蛋白質含量（n=6）

在對大量不同種類的農產品進行檢測分析后發現，使用彈性的校正系數能夠拉近兩種方法的粗蛋白質含量差異（Simonne et al.，1997），并建議以0.89對應蔬菜，0.95 對應谷物，0.94 對應肉類，0.73 對應水果。可以看出，不同種類、不同基質樣品的校正系數間差別較大。經驗證后發現，系數0.89 對本試驗涉及的大部分蔬菜有較好的校正效果，但并不完全適用。鑒于此，結合方法原理可以推測：蔬菜種類多、基質差別大，可能對檢測方法的氮轉化效率造成了一定影響，導致兩種方法結果出現差異，但還需要進一步的研究確證。

3 結論

采用杜馬斯法和凱氏法對常見的15 種蔬菜粗蛋白質含量進行檢測。經比較分析得出：杜馬斯法相比凱氏法有效減少了對人員健康和生態環境造成的危害，充分解放了人力、降低了試驗能耗；兩種方法的CV和回收率均能滿足方法確認要求，結果間精密度滿足國標要求；高硝態氮含量并不是造成檢測結果差異顯著的唯一原因，蔬菜基質對方法氮轉化效率的影響可能是另一重要原因，但還需進一步研究確證。

綜上所述，杜馬斯燃燒定氮法和凱氏定氮法在蔬菜粗蛋白質檢測領域均能提供準確、可靠的檢測結果，其中杜馬斯法在環保與檢測效率方面更具優勢。國內外文獻結果表明，杜馬斯法相比凱氏法確實有明顯向好的發展趨勢，但由于不同國家、地區對檢測標準有不同的要求，所以短期內仍無法相互取代，可以預見兩種方法還將在特定的領域長期互補、共存。