菜豆凝集素含量性狀的遺傳研究

任三國 陳偉達 邵景杰 盧 爽 陳 高 陳禪友

〔江漢大學生命科學學院，湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心，湖北武漢 430056〕

菜 豆（Phaseolus vulgarisLinn）（2n=2x=22）屬于豆科（Leguminosa）菜豆屬，是世界性栽培作物。我國菜豆種質資源豐富，是菜豆種植和消費大國。按食用器官不同，菜豆可分為粒用菜豆和食莢菜豆兩種類型（Bin et al.，2016）。我國以栽培食莢菜豆作為蔬菜食用為主，其蛋白質含量高，富含多種礦物質等營養(yǎng)元素，且風味口感好，是人們喜食的主要蔬菜之一。但由于菜豆商品莢中存在內源致毒物質，因不當食用而導致的中毒事件時有發(fā)生（楊帆，2015）。

研究發(fā)現，菜豆食用部分存在內源抗營養(yǎng)因子，如植酸（Canellas &Olivares，2014）、植物凝集 素（PHA）（Weder et al.，1997；Vasconcelos &Oliveira，2004）、胰蛋白酶抑制劑（Bezerra et al.，2017）和皂苷（Couto et al.，2014；馮國軍和劉大軍，2016）等，其中PHA 是重要的植物抗營養(yǎng)因子，也是引起菜豆食物中毒的主要化學成分。前人對菜豆植物凝集素的含量分析和凝血活性等研究均有報道，李笑梅和韓春然（2009）通過對8 個菜豆品種凝血活性的定量分析，指出菜豆毒性存在基因型差異和栽培季節(jié)差異；尚蕊等（2015）和任三國等（2016，2017）報道了233 份菜豆自然群體凝集素含量水平信息，且篩選出了一批凝集素含量差異很大的核心種質材料；金雯燕等（2016）和劉芳塵等（2017）對凝集素抑制腫瘤細胞增殖進行了應用探究；馬艷芳（2018）探究了紅蕓豆凝集素對小鼠學習記憶和情緒相關神經行為的影響。要實現菜豆低凝集素水平的種質創(chuàng)新和品種選育目標，首先需要明確該性狀的遺傳規(guī)律，然而菜豆凝集素水平性狀遺傳研究鮮見報道。

本試驗在前期對233 份食莢菜豆商品成熟莢PHA 含量性狀檢測的基礎上，選取6 個不同PHA水平的品種，人工雜交配制了4 個組合，通過雜種后代培育程序構建了F1和F2遺傳群體，同期進行田間試驗，檢測所有親本、F1和F2群體單株商品莢的PHA 含量，進行雜種后代該性狀的顯性度測定、方差分析、分離譜展示和廣義遺傳力估算等，旨在從理論上揭示菜豆PHA 含量性狀的遺傳特性。此外，依據育種目標，在F2群體分離出的重組體中篩選出低PHA 兼具優(yōu)良農藝性狀的單株，為低PHA含量菜豆的種質創(chuàng)新和遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在前期開展菜豆種質資源PHA 含量分析的基礎上進行菜豆PHA 含量遺傳研究，選取了2 個PHA 含量較高的種質SJ-0051 和SJ-0053，以及2 個PHA 含量較低的種質SJ-0119 和SJ-0206進行雜交配組，同時選取2 個綜合農藝性狀（莢長、莢寬、單莢質量、單株莢數等）優(yōu)良但PHA 含量中等的材料SJ-0009 和SJ-0021 作母本，以PHA含量較低的SJ-0119 和SJ-0206 作父本，配制雜交組合，并通過雜交后代培育程序，構建親本及其雜交后代遺傳群體。親本材料的基本信息見表1。

表1 供試親本材料的來源與特征

1.2 田間試驗與檢測方法

田間試驗在江漢大學湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心基地進行，試驗地土壤肥力均勻一致，栽培管理按常規(guī)技術進行。2017年春季種植6 個親本，共配制4 個雜交組合，分別為SJ-0053 × SJ-0119、SJ-0051 × SJ-0206、SJ-0009 × SJ-0206和SJ-0021 × SJ-0119，編號為雜交組合1、2、3、4，分別收獲F1種子。2018年春季種植部分F1種子，自交得到F2群體。2019年春季種植各親本群體（30株）、F1群體和F2群體，從各遺傳群體中分單株采摘商品莢（開花后15 d），田間分別收取各單株成熟商品莢12 個，室內取莢中部小段，研磨成漿，用磷酸鹽緩沖液（PBS）抽提PHA，進行單株豆莢PHA 含量測定，采用改良的酶標儀凝血吸光度方法（任三國 等，2016），重復3 次。

1.3 數據分析

親本及雜交后代田間試驗中檢測的菜豆商品莢PHA 含量數據，采用單向方差分析進行F檢驗。

F1遺傳的顯性度按如下公式計算：hp=2|（F1-Mp）|/（P1-P2），其中hp表示顯性度；Mp表示兩親本群體中親值，F1表示群體PHA 含量，P1和P2表示親本群體PHA 含量（裴新澍，2000）。

將F2分離出的PHA 含量極低的菜豆重組體單株，結合單株莢數和單莢質量等重要農藝性狀表現值，對其進行綜合評分和株選。

試驗數據運用DPS 軟件和Excel 軟件在計算機上進行運算。

2 結果與分析

2.1 菜豆雜交F1 PHA 含量的數據特征和遺特性傳

對親本及其F1植株商品莢進行PHA 含量測定，結果顯示（表2），3 個菜豆雜交組合的F1商品莢PHA 含量均值介于2 個雜交親本的均值之間，其中雜交組合1 和雜交組合2 低于中親值，表現為小親本不完全顯性遺傳；雜交組合4 的F1商品莢PHA 含量高于中親值，表現為大親本不完全顯性遺傳；而雜交組合3 的F1商品莢PHA 含量高于大親本，表現為超顯性遺傳。

表2 菜豆F1 基于PHA 含量的遺傳分析

2.2 菜豆F2 群體的PHA 水平檢測及其遺傳分離特性

2.2.1 菜豆F2單株和群體的PHA 含量測定結果及其變異分析 4 個F2群體中PHA 含量測定的單株數量分別為68、73、215、281 株。從表3 可以看出，各群體分離譜較廣，且均分離出PHA 含量高于大親本（高PHA 含量親本）的單株（組合1～4單株數量分別為6、1、6、26 株）和低于小親本（低PHA 含量親本）的單株（組合1～4 單株數量分別為39、68、88、141 株），又以低于小親本的單株數量居多，導致群體的PHA 含量均值都小于中親值，大量重組體分布于中親值的偏低一側。

表3 菜豆F2 群體PHA 含量變異分析

從表3 還可以看出，不同組合F2群體的變異系數差別很大，說明不同基因型雜交后分離程度存在明顯差異。

2.2.2 菜豆F2群體方差及遺傳力分析 在測定了4個雜交組合F2群體各單株PHA 含量的基礎上，對PHA 含量依組合進行方差分析。結果表明（表4），各組合F2群體內單株間（處理間）PHA 水平差異極顯著（P＜0.01），F值較大，也說明F2的PHA含量性狀發(fā)生了極顯著分離。此外，基于PHA 含量的性狀廣義遺傳力估計結果均達到了95%以上（表5），說明菜豆商品莢中PHA 含量主要取決于基因型效應，即相關控制基因在該性狀決定中起重要作用，環(huán)境起修飾作用。

表4 菜豆F2 群體PHA 含量的方差分析

表5 4 個菜豆雜交組合PHA 廣義遺傳力估計

2.2.3 菜豆F2PHA 含量的單株頻率分布 根據F2群體內單株PHA 含量的測定結果，依組合分析F2群體單株頻率分布，并繪制分布曲線（圖1、2）。由圖1、2 可知，4 個F2群體PHA 含量的單株頻率均呈現出連續(xù)分布的特點，其中雜交組合1、雜交組合2 和雜交組合4 的峰值均明顯低于小親本（即對應的低PHA 含量的親本），雜交組合3 的峰值在小親本附近。前述的雜交組合1、雜交組合2 和雜交組合4 的F2群體中PHA 含量低于小親本的單株比例很高，此處表現為分布曲線的主峰偏離。分布曲線還表明存在兩尾單株分布頻率，為篩選極低（高）PHA 含量重組體奠定了理論基礎和種質創(chuàng)新機會。

2.2.4 菜豆PHA 性狀遺傳研究的育種應用 通過以上分析，篩選到F2分離出的PHA 含量極低的菜豆重組體單株，其中一些單株PHA 含量明顯低于現有品種的PHA 含量，再結合單株莢數和單莢質量等重要農藝性狀表現值，對其進行綜合評分和株選。通過綜合評分，篩選出6 個性狀表現優(yōu)良的重組體（表6），PHA 含量明顯低于現有品種且兼具優(yōu)良農藝性狀。

表6 菜豆F2 中優(yōu)良重組單株性狀表現值及其綜合評分

3 討論與結論

植物作為人類重要的食物來源，其食用安全性備受關注。目前已在多種作物中發(fā)現了內源毒素物質，比如油料作物油菜中的芥酸和硫代葡萄糖甙（張立實和王瑞淑，1986；李云昌 等，2006），棉花中的棉酚（王利和汪開毓，2002；侯紅利和羅宇良，2005），馬鈴薯中的龍葵素（董曉茹 等，2013；鄧孟勝 等，2019），木薯中的亞麻仁苦苷（安飛飛 等，2017），菜豆中的PHA（Weder et al.，1997；Vasconcelos &Oliveira，2004）等。對這些抗營養(yǎng)因子進行遺傳改良，從根本上解決潛在的食品安全問題具有重要意義，如育成的雙低油菜品種很好地解決了油菜的食品安全性問題（農全東 等，2014）。迄今，菜豆的一些重要農藝性狀的遺傳研究有所進展（Perez-Vega et al.，2010；Yuste-Lisbona et al.，2014；Vasconcellos et al.，2017；Sandhu et al.，2018），但其PHA 含量的遺傳研究鮮見報道。鑒于此，本試驗通過人工雜交構建遺傳群體和性狀定量檢測等程序，探索了菜豆PHA 含量的遺傳規(guī)律。

本試驗結果表明，F1群體的單株間PHA 含量變異很小，說明親本純合度高，也與菜豆為嚴格自花授粉植物導致缺乏基因交流和多年保純繁育密不可分；F1的性狀并未呈現出雜種優(yōu)勢或者優(yōu)勢不明顯，主要表現為單一親本不完全顯性遺傳；親本的基因型差異對雜交后代優(yōu)勢強度有明顯影響。F2的性狀發(fā)生明顯分離，總變異主要是由單株間的變異所決定，環(huán)境誤差處于次要地位；將F2群體按照PHA 含量高低的單株頻率分布繪制曲線，表現出連續(xù)性，主峰明顯，在兩尾極低和極高區(qū)域也有單株分布，且分離程度和分布頻率均依雜交組合而異。依據親本、F1及F2在相同栽培環(huán)境下該性狀表現值進行廣義遺傳力估算，結果均高于95%。這些都說明菜豆PHA 含量性狀表現為數量性狀遺傳特征，該性狀主要是由基因所決定，環(huán)境起修飾作用。因此，本試驗明晰了菜豆PHA 含量是一個典型的數量性狀，這為后續(xù)進行QTL 分析等奠定了理論基礎，也提供了研究材料。

解決菜豆內源毒素引起的食用安全隱患問題最根本有效的途徑在于降低物種自身PHA 等抗營養(yǎng)有害物質生成水平。清除或使菜豆內源毒素失活能避免食用菜豆導致的中毒事件，尤其是群體中毒事件的發(fā)生，促進菜豆的生產和消費，也有利于節(jié)省高溫烹飪帶來的能源消耗，并降低CO2環(huán)境釋放量。因此低PHA 含量菜豆遺傳改良是一項非常緊迫的任務，而關鍵在于種質創(chuàng)新。本試驗中，親本及其配組對F1表現及F2分離等方面有強烈影響，說明在該性狀的遺傳改良程序中正確選擇選配親本至關重要，需要運用現代生物技術強化對菜豆種質資源的研究和認識；另一方面，本試驗所構建的F2群體中有PHA 含量低于小親本的重組體出現，這為低PHA 含量菜豆種質創(chuàng)新提供了理論依據和技術途徑。但是并不是任意的雜交組合都能夠實現目標，本試驗配制了4 個雜交組合，從2 個F2群體分離出的極低PHA 重組體結合農藝性狀綜合評分篩選到6 株材料，可作為創(chuàng)新種質材料，供低PHA 含量菜豆新品種選育利用。