黃秋葵鹽脅迫下的轉錄組分析

練冬梅 賴正鋒 姚運法 洪建基

（福建省農業科學院亞熱帶農業研究所，福建漳州 363005）

土壤鹽漬化是影響植物生長和威脅農業生產的主要非生物脅迫之一，也是一個在世界范圍內不斷蔓延的問題（Campbell et al.，2015；Ozfidan-Konakci et al.，2015）。鹽漬化土壤中高濃度的NaCl 在不同生理水平上影響植物生長，導致植株水分缺失、離子毒性、營養失衡和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，引起蛋白質和核酸損傷，生長和產量下降，甚至導致植株死亡（Xiong et al.，2017）。植物已經進化出對不同程度鹽脅迫的耐受性，例如，在鹽脅迫下植物通過積累可溶性滲透保護物質如脯氨酸、多醇甜菜堿和可溶性糖進行滲透調節（Sun et al.，2017）。

黃秋葵（Abelmoschus esculentusL.）為錦葵科一年生或多年生特色保健蔬菜，主要分布于熱帶亞熱帶地區，具有生長勢強、割莖再生能力強（劉勇 等，2015）、抗逆性較強（Chandra et al.，2016）等特點，適宜在輕、中度鹽堿區種植，因此黃秋葵在我國沿海地區種植面積較大（劉雅輝 等，2017）。近年來，國內外學者研究了鹽脅迫對黃秋葵生態特征、生理生化的影響（王永慧 等，2015，2016；Jeyapraba et al.，2016；劉雅輝 等，2017；王繼玥 等，2017；Azeem et al.，2017；Guealia et al.，2017），還進行了蛋白質組分析（Yu et al.，2019；Zhan et al.，2019），但對鹽脅迫下黃秋葵幼苗轉錄組分析鮮見報道。在高等植物鹽脅迫研究中，轉錄組測序技術已應用于冰菜（練冬梅 等，2019）、偃麥草（盧銳和李培英，2020）、長豇豆（Pan et al.，2019）等植物中。前人研究表明，鹽對植物地上部生長的抑制作用大于地下部（朱義 等，2007；谷艷芳 等，2009）。本試驗以福建漳州沿海地區常年種植的黃秋葵品種助農2 號為試驗材料，對400 mmol·L-1NaCl脅迫24 h后的黃秋葵地上部進行轉錄組分析，以期獲得與耐鹽性狀相關的調控基因，為黃秋葵耐鹽基因組學和分子生物學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年5 月在福建省農業科學院亞熱帶農業研究所進行。黃秋葵（AbelmoschusesculentusL.）品種助農2 號的種子購于福建漳州種子商店。

1.2 鹽脅迫處理

黃秋葵種子經10%次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3 次，置于恒溫箱中催芽。種子露白后播于裝有泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=3V∶1V∶1V干凈基質的7 cm × 7 cm × 10 cm（長×寬×高）花盆中，共播種6 盆，每盆播1 粒，置于人工氣候箱中培養，發芽7 d 后開始每2 d 澆1 次1/2 Hoagland營養液，待幼苗長至三葉一心時，選擇生長一致的幼苗用400 mmol·L-1NaCl 進行脅迫處理24 h，對照用清水處理24 h。

1.3 采樣

分別取鹽脅迫處理和對照24 h 后的黃秋葵幼苗地上部分，各3 次重復。鹽脅迫處理的3 次生物學重復分別記為T01、T02、T03；對照的3 次生物學重復分別記為T04、T05、T06。迅速放入液氮速凍，存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.4 轉錄組測序和分析

采用RNAprep Pure Plant Kit 試劑盒提取黃秋葵幼苗地上部分總RNA。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100 技術檢測RNA 樣品的純度、濃度和完整性，構建cDNA 文庫，再使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后，用Illumina HiSeq TM2500 進行高通量測序。運用生物信息學技術和方法對測序數據進行前期處理、序列比對、基因及基因組的注釋、基因表達分析等。按照FPKM 法計算差異基因的表達量，若log2Fold change ＞0，則上調表達，反之，下調表達。

2 結果與分析

2.1 數據組裝和分析

鹽脅迫處理和對照的黃秋葵幼苗經高通量測序和質量控制，共獲得70.17 Gb 有效數據（Clean data），Q30 堿基百分比均在93.21%以上（表1），表明測序結果可靠，可用于后續的分析。對組裝結果進行統計（表2），共產生60 177 條單基因序列（Unigene）和342 407 條轉錄本序列（transcipt），N50 分別為1 569 bp 和1 870 bp，組裝完整性較高；其中長度為300～500 bp 的單基因序列數量最多，為24 506 條，占40.72%，且隨著長度的增加，單基因序列的數目減少。

表1 有效數據評估統計

表2 組裝結果統計

2.2 單基因序列功能注釋

為獲得Unigene 的功能注釋信息，通過COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG 和NR 等8 個數據庫進行注釋分析（表3），在60 177 條Unigene 中，共獲得38 087 條（63.29%）注釋，以上8 個數據庫分別獲得9 879（16.42%）、22 205（36.90%）、14 417（23.96%）、20 320（33.77%）、23 009（38.24%）、25 661（42.64%）、34 294（56.99%）、37 176 條（61.78%）注釋。

表3 單基因序列的功能注釋

2.3 差異表達基因分析

通過對黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對照24 h后地上部分差異基因的表達分析，共獲得1396個差異表達基因（differential expression genes，DEGs），包括588 個上調基因，808 個下調基因，將其DEGs 單基因序列分別在8 個數據庫中進行注釋，共獲得1 266 個基因功能注釋，COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG 和NR數據庫分別注釋405、743、421、581、918、994、1 197 個和1 263 個，其中以NR 數據庫注釋比率最高，達99.76%。

2.3.1 差異表達基因的GO 功能注釋 黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對照24 h 后地上部分差異基因GO功能注釋的743 個DEGs 共分為3 大類，分別為生物過程、細胞組分和分子功能，又劃分為43 個功能小類（圖1），生物過程的DEGs 以代謝過程（43.1%）、細胞過程（35.5%）和單一生物過程（30.6%）3 個功能小類的數量最多；細胞組分的DEGs 以內膜（43.2%）、內膜組分（36.5%）、細胞（33.5%）、細胞組分（33.0%）和細胞器（21.1%）5 個功能小類的數量最多；分子功能的DEGs 以催化活性（49.7%）和結合活性（46.4%）2 個功能小類的數量最多。以上注釋較多的過程涉及到的基因可能參與了黃秋葵鹽脅迫響應過程，進一步挖掘這些差異表達基因有助于研究其抗逆機制。

2.3.2 差異表達基因的KOG 功能注釋 對黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對照24 h 后地上部分差異基因KOG 數據庫注釋的581 個DEGs 進行直系同源分類，獲得24 個功能分類（圖2），主要集中在一般性功能預測（23.1%）。植物生長發育過程有大量基因表達，在鹽脅迫下，部分涉及到信號轉導機制（13.3%），以及次生代謝產物的合成、轉運和分解代謝（11.9%），翻譯后修飾、蛋白質轉換和伴侶（10.5%）等過程，說明這些生物學過程對于黃秋葵生命活動的重要性。

2.3.3 差異表達基因的KEGG 功能注釋 KEGG分析可以從功能的角度聚焦到通路及基因，也可以從基因的角度鎖定功能和互作關系，直觀地顯示黃秋葵在鹽脅迫下差異表達基因的代謝過程和信號通路，有助于更好地研究黃秋葵響應鹽脅迫的分子機制。由表4 可知，黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對照24 h 后地上部分差異基因分別富集在421 個KEGG代謝通路，主要分為5 類：第1 類為細胞過程，涉及到1 個通路，為內吞作用；第2 類為環境信息處理，共有2 個通路，分別為植物激素信號轉導和ABC 轉運蛋白；第3 類為遺傳信息處理，涉及到5 個通路，以內質網蛋白加工最多；第4 類為新陳代謝，共有40 個通路，最多的為淀粉和蔗糖代謝（8.9%），其次為苯丙素的生物合成（6.7%）；第5類為有機系統，共有2 個通路，分別為植物病原菌互作和晝夜節律-植物。這說明鹽脅迫下黃秋葵幼苗的各種代謝途徑都發生了變化。

表4 差異表達基因KEGG 功能注釋

2.4 關鍵基因差異分析

通過對黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對照24 h 后地上部分轉錄組測序結果進行功能注釋、功能分類及代謝途徑分析表明（表5），過氧化物酶55 基因、超氧化物歧化酶基因、谷胱甘肽S-轉移酶基因、4-羥基肉桂酸基因、黃酮醇合成酶基因、查爾酮合成酶基因上調表達，主要參與植物體內抗氧化及活性氧清除過程；WRKY21 轉錄因子基因、ERF2 轉錄因子基因、NAC29 轉錄因子基因、GATA22 轉錄因子基因、MYB4 轉錄因子基因、生長素響應蛋白基因上調表達，主要參與植物生長發育過程；海藻糖-磷酸酶基因、磷酸乙醇胺N-甲基轉移酶1 基因上調表達，主要參與植物滲透調節過程。

表5 鹽脅迫下黃秋葵幼苗差異基因的表達

3 討論與結論

土壤鹽分是限制植物生長的主要非生物脅迫之一，研究植物耐鹽機制將有助于改進植物耐鹽性。黃秋葵具有復雜的異源多倍體基因組（2n=130～140），近年來，人們開始關注黃秋葵種質的遺傳改良（Zhang et al.，2018）。本試驗利用Illumina HiSeq TM2500 高通量測序技術構建了黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對照24 h 后地上部分轉錄組數據庫，借助其他物種數據庫的已有信息，對差異表達的基因進行比對分析，表明鹽脅迫后黃秋葵幼苗地上部分的植物活性氧清除、植物生長發育及植物滲透調節相關功能蛋白基因的表達發生了改變。

鹽脅迫導致植物體內活性氧（ROS）積累，過量的ROS 氧化植物細胞，對植物造成不可逆的傷害（Sekmen et al.，2014）。植物可能通過合成大量的ROS 清除相關的酶類和其他次生代謝物質，來降低植物受到的氧化損傷。研究表明，過氧化物酶體、黃酮、谷胱甘肽等抗氧化劑在植物體內具有抗氧化和ROS 清除能力（孫靜，2006；Watkins et al.，2014；Silva et al.，2016）。鹽脅迫下，黃秋葵幼苗中過氧化物酶55 基因、超氧化物歧化酶基因、谷胱甘肽S-轉移酶基因、4-羥基肉桂酸基因、黃酮醇合成酶基因、查爾酮合成酶基因上調表達，有利于合成過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和黃酮，促進黃秋葵體內ROS 清除，提高黃秋葵的鹽脅迫耐受性。

植物中各類轉錄因子在調控植物生長發育、適應環境中起到主要作用（趙航 等，2014）。屈興紅和曾洪學（2019）研究發現，金冕草受到鹽脅迫后會引起MYB 和WRKY 轉錄因子的強烈表達。田林等（2020）研究表明，比拉底白刺通過WRKY、ERF、NAC、GATA 轉錄因子調控來增加耐鹽性。本試驗通過轉錄組測序發現，黃秋葵幼苗鹽脅迫處理和對照24 h 后WRKY21 轉錄因子基因、MYB4 轉錄因子基因、ERF2 轉錄因子基因、NAC29 轉錄因子基因、GATA22 轉錄因子基因均上調表達，有利于增強黃秋葵幼苗耐鹽性，與前人研究結果一致。植物激素在鹽脅迫下植物生長發育中也起到重要作用（練冬梅 等，2019）。本試驗中，生長素響應蛋白基因上調表達，促進細胞分裂，加速細胞伸長生長，提高黃秋葵的鹽脅迫耐受性。本試驗發現的幾個轉錄因子需要進一步挖掘其功能，以期探究黃秋葵的耐鹽機理。

鹽脅迫下，植物通過自身合成小分子有機溶質（糖類、甜菜堿、醇類等）維持細胞滲透勢，從而減少鹽脅迫損傷（黎裕，1994）。在本試驗的關鍵差異表達基因中，海藻糖-磷酸酶基因、磷酸乙醇胺N-甲基轉移酶1 基因上調表達，分別有利于合成海藻糖和甜菜堿，以提高細胞內的滲透勢，從而提高黃秋葵的鹽脅迫耐受性。

植物是通過一系列基因相互協調發揮作用來實現耐鹽性的（Zhou et al.，2013）。黃秋葵經400 mmol·L-1鹽脅迫后，在一系列關鍵基因共同作用下進行自我調節，能夠正常生長發育，抵抗鹽脅迫的危害。本試驗中所篩選的抗氧化及活性氧清除相關基因、植物生長發育相關基因和滲透調節相關基因均為上調基因，證明黃秋葵能夠通過增強活性氧清除、促進生長發育和滲透調節來提高鹽脅迫適應能力。本試驗從分子水平上研究了對應的耐鹽基因及其差異表達，為篩選黃秋葵耐鹽關鍵基因和功能驗證提供重要的分子基礎，同時為改善土壤鹽漬化具有重要意義。