遺傳修飾技術在綿羊分子設計育種中的應用

王海濤，李亭亭，黃勛，馬潤林,4，劉秋月

遺傳修飾技術在綿羊分子設計育種中的應用

王海濤1,2，李亭亭3，黃勛1,2，馬潤林1,2,4，劉秋月1

1. 中國科學院種子創新研究院，北京 100101 2. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所，分子發育生物學國家重點實驗室，北京 100101 3. 浙江農林大學，杭州 3113004. 中國科學院大學，北京 100049

利用遺傳修飾技術可以使動物在遺傳水平發生改變，實現在個體內表達外源基因或對其內源基因的功能造成影響。在動物育種中，可以利用遺傳修飾技術在分子水平進行設計并實現品種的快速改良。從傳統的遺傳修飾技術、病毒載體、精子載體等介導的遺傳修飾技術到新型人工核酸酶介導的基因編輯技術，尤其是CRISPR/Cas9為代表的人工核酸酶的運用使得基因編輯動物的制備變得更加高效快捷，并迅速在多個物種中得到應用。這些方法也已經拓展到了綿羊()遺傳育種領域。利用遺傳修飾技術在綿羊中進行分子育種比傳統的育種方式具有更大的優勢，可以使用多種策略直接對性狀進行快速改良，并且可以加快育種進程。本文詳細介紹了遺傳修飾技術在綿羊中的研究歷程，探討了通過遺傳修飾技術進行綿羊分子設計育種的可能性，并提出以上技術和方法在綿羊育種中面臨的問題和挑戰。

綿羊；遺傳修飾；基因編輯；動物育種

綿羊()是畜牧業中重要的農業動物之一，約在1萬年前即被人類所馴化[1]，主要為人類提供皮毛、肉類和奶制品等。為了獲得具有優良性狀的綿羊品種，人們通過各種方式進行品種的選育，期望獲得具有較高肉奶產量、生產優質皮毛或具有較高抗病能力的綿羊品種。傳統的育種方式是通過表型選擇將優良性狀個體進行保留。整個過程需要對其親本進行選種，包括選定親本品系、確定雜交組合、雜交代數等。為了固定表型，需要采用適當的近交，但近交會引起動物的表型退化、品質衰退等。雜交產生的后代也會出現性狀分離的現象，育種過程非常緩慢且復雜。

自基因的概念提出以來，分子生物學和基因工程理論和技術獲得了較大的發展，明確了遺傳變異可以引起性狀的改變。因此，可以通過對基因進行修飾或編輯實現新品種培育。通過物理或化學誘變可以在動物中實現誘變育種[2]，但誘變產生的基因突變往往是隨機性的，并且會產生無育種價值的性狀或不利于育種的性狀。遺傳修飾育種直接針對調控性狀的基因，通過轉基因或基因編輯等方式對基因進行分子設計，在保留品種固有優良性狀的基礎上，引入新性狀，改善劣勢性狀，而且可以突破品種的局限，將其他物種的性狀引入，從而克服物種間的生殖隔離，把不同物種的優質性狀集合和重組，實現定向選擇育種。分子設計育種相比傳統育種在可預見性和選擇上有了極大的提高。

通過遺傳修飾在動物中進行分子設計育種，理論上僅需要一個世代就能獲得穩定遺傳的品系，可以大大縮短育種時間，降低育種成本。通過直接對基因進行操作，在獲得的基因修飾個體中就能獲得穩定的基因型。基因修飾操作的過程對個體的要求較低，需要品種內具有典型性狀的個體提供體細胞、胚胎或卵細胞即可。基因修飾個體的制備需要代孕母畜，但代孕受體的選擇標準也較為寬松，不需要本品種內的最優個體，可以用物種內其他品種中具有優良繁殖能力的個體，拓寬了選擇范圍，同時保有一定數量的受體即可。通過規模化的基因修飾，可以在短時間內獲得一定數量的基因修飾動物群體。通過將獲得的純合子進行交配，對群體進行擴繁，可以在幾代之內就建立相當規模的穩定遺傳品系，相較于雜交育種縮短了時間，提高了效率。

1 遺傳修飾技術在綿羊中的應用

在綿羊等大動物中，遺傳育種對性狀的改良主要包括改善原有性狀以及引入新性狀。可以轉入外源基因序列以獲得原物種不具備的表型或功能。遺傳修飾的方式最初為外源基因的隨機插入或同源重組介導的插入或刪除，同時需要借助受精卵顯微注射或體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)的方式獲得遺傳修飾綿羊。在自然情況下同源重組發生的概率極低，只有10–6[3]，遺傳修飾細胞的篩選難度較大，適合在干細胞中進行篩選，而綿羊的干細胞體系目前并不成熟。因此，提高同源重組效率成為分子設計育種中的關鍵。

在以人工核酸酶為代表的基因編輯技術出現后，以CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)系統為代表的基因編輯逐漸成為遺傳修飾的常用方法。人工核酸酶系統通過提高DNA雙鏈斷裂效率來提高同源重組的效率，其原理為：當基因組中出現雙鏈缺口時，啟動基因組損傷修復機制，包括非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)修復，或者存在同源供體的情況下，啟動同源重組修復(homology- directed repair, HDR)，將外源基因引入至重組區域[4]。因此，提高基因組中雙鏈斷裂的效率，就能提高同源重組的能力，從而提高基因打靶效率，可以使隨機的重組效率由原來的10–7～10–6提高至10–2～10–1。借助新型基因編輯工具，不僅能實現外源基因在受體中穩定高效的表達，還可以實現基因組中序列的缺失、堿基替換和插入等，造成移碼突變、氨基酸轉換等。基因編輯工具的出現極大地豐富了遺傳修飾的方法和策略。遺傳修飾技術發展及在綿羊中的應用進程如圖1所示。

制備遺傳修飾大動物涉及多種原理和技術的應用以及繁雜的操作流程(圖2)。原理方面涉及隨機插入、同源重組、DNA堿基修復、轉座子、RNAi轉錄后調控等分子生物學基礎概念。將這些概念轉化為實際可操作的技術，首先需要根據實驗目的構建相應質粒載體，其次要實現載體向細胞、胚胎甚至個體的轉移。操作技術包括：脂質體/病毒/精子等方法進行載體遞送，mRNA或蛋白質的直接顯微注射，體細胞核移植技術等獲得基因被修飾的個體。總體可分為以下3部分：(1)獲得目的基因序列并通過限制性內切酶的酶切連接，制備攜帶外源基因或具有敲除、點突變或干擾等功能的載體。例如具有同源重組功能的載體，以及表達外源基因、轉座子酶、siRNA、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFN)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases, TALEN)或CRISPR/Cas9等元件的載體，或者體外獲得具有基因修飾功能的mRNA或蛋白質。(2)通過細胞轉染、病毒遞送或顯微注射等方式將載體、mRNA或蛋白質轉入體細胞或早期胚胎中，對供體細胞或受精卵基因組進行遺傳修飾。(3)發生基因修飾的供體細胞或受精卵再通過體細胞核移植技術或胚胎移植技術移入受體動物子宮內，從而獲得包括綿羊在內的多種遺傳修飾動物。

圖1 遺傳修飾技術及其在綿羊中應用的里程碑事件

圖2 制備遺傳修飾綿羊流程圖

制備遺傳修飾綿羊之前，需要確定候選基因，通過載體構建獲得具有各種候選基因修飾功能的載體。通過載體轉染或各種遞送方式，在供體細胞或受精卵中載體表達并對基因組進行修飾或編輯。獲得的遺傳修飾胚胎移植入受體母羊中發育并獲得遺傳修飾綿羊。

1.1 傳統的遺傳修飾方法

在高效基因編輯技術建立以前，在綿羊中主要通過基因組本身的同源重組或外源片段隨機插入對基因進行修飾，并結合顯微注射或體細胞核移植技術獲得遺傳修飾個體。使用這種遺傳修飾方式，在基因組中發生基因編輯或重組的效率較低，插入位點具有隨機性，并且容易產生嵌合體等特點。通過顯微注射和體細胞核移植技術獲得的轉基因綿羊研究結果見表1。與最早獲得的轉基因小鼠()類似，第一只轉基因綿羊也是通過顯微注射獲得。1985年，研究者將人生長激素基因(human growth hormone,)通過顯微注射注入綿羊胚胎，通過胚胎移植入代孕受體中獲得第一只轉基因綿羊[6]。在后續較長時間內，人們通過顯微注射制備了多種轉基因綿羊，如轉羊生長激素基因的綿羊[18,19]以及轉Visna病毒糖蛋白綿羊等[20]。

克隆羊多莉的誕生標志著哺乳動物體細胞克隆技術的建立[9]。利用體細胞篩選獲得穩定整合外源基因的單克隆細胞作為細胞核供體，經過核移植和胚胎移植技術產下預期性狀的克隆后代，同時不存在顯微注射產生嵌合的問題。研究人員最早通過此方法獲得了能夠在羊乳中表達人凝血因子的轉基因綿羊[10]。2001年英國的羅斯林研究所通過同源重組結合體細胞克隆技術獲得了(ovine prion protein)和(α(1,3)galactosyl transferase)定點敲除的綿羊[30]。該技術獲得的細胞供體是通過同源重組獲得的基因敲除單克隆細胞，因此再通過體細胞核移植獲得的克隆后代均為陽性個體。McCreath等[31]也通過同源重組及體細胞核移植技術獲得了(ovine α1(I) procollagen)定點插入(α1-antitrypsin)的基因修飾綿羊。

表1 通過顯微注射和體細胞核移植技術獲得的遺傳修飾綿羊

顯微操作技術理論上可以在任何能獲得卵細胞的動物中進行操作，甚至可以在胚盤下腔注射以獲得遺傳修飾禽類，而體細胞核移植只能對兩棲類、魚類和哺乳類卵細胞進行操作。通過顯微注射技術制備遺傳修飾動物時，在原核形成到第一次卵裂之間進行顯微操作，才能盡可能的避免產生嵌合體。早期獲得遺傳修飾動物的效率較低，使得顯微注射獲得的個體大多數為野生型或嵌合體。而體細胞核移植技術可以將大量的篩選工作在細胞水平進行，避免在出生的后代中產生大量陰性個體或嵌合體。

1.2 精子載體、慢病毒載體、轉座子介導的遺傳修飾

顯微注射或體細胞核移植技術是將遺傳修飾載體導入早期胚胎或細胞的傳統方式，此后又發展出利用精子或病毒等生物載體的導入方式。精子載體法的原理為，通過將精子與DNA共孵育后，將攜帶DNA的精子受精，從而獲得基因修飾的受精卵；或者在綿羊睪丸中直接注射外源載體，載體進入精子后再進行交配獲得基因修飾后代。多個團隊分別通過這種方法制備了(solute carrier family 7 member 11)[34]、(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)[35]和(lipoprotein lipase)[36]的轉基因綿羊，并獲得了具有表型的F1后代。但這種方法的重復性較差且效率較低。

慢病毒載體介導的基因修飾依賴于病毒感染細胞的能力，通過將慢病毒注射到綿羊卵子或胚胎，實現基因轉移。通過慢病毒載體感染，已獲得了轉(green fluorescent protein)轉基因羊[37～39]以及具有更高產毛性能的轉(fibroblast growth factor 5)綿羊[40]。結合顯微注射和慢病毒載體的方法，也獲得了轉入外源基因表達量較高的后代[41,42]。病毒載體遞送質粒相對于顯微注射法和體細胞核移植方法相對簡單，甚至在小鼠中可以直接通過鼻腔或氣管滴入的方法遞送到肺部進行基因編輯[43]，但這一方法在大動物中還未見報道。此外，使用病毒載體法獲得遺傳修飾動物在安全性方面也會受到限制。

在基因組中存在具有特殊功能的序列，也可被用于實現綿羊中基因遺傳修飾。例如構建表達轉座酶的質粒載體并結合其他遞送方法，即利用轉座子的轉座活性將序列插入基因組中特定區域，在綿羊中已有報道(表2)。Bevacqua等[44]通過Tn5或SB (sleeping beauty)轉座子載體結合顯微注射成功獲得了遺傳修飾綿羊個體；Hu等[45]則通過SB轉座子介導的RNAi獲得了(myostatin)敲低的綿羊個體。

一般情況下，精子載體和慢病毒載體介導的遺傳修飾技術不需要依賴精密的儀器設備和復雜的技術操作，相比顯微操作和體細胞和移植技術成本較低。利用轉座子介導的遺傳修飾，是在高效精確的人工核酸酶技術規模運用之前的有效修飾方法。人工核酸酶技術出現后，憑借在修飾效率上的巨大優勢，成為了在農業動物中的遺傳修飾的主要方法。然而，技術的創新無法突破動物生殖方式的局限，畜禽動物本身的生殖方式決定了對其進行遺傳修飾操作時，可選擇的載體遞送方式以及修飾難度存在差異。例如，哺乳動物可獲得卵母細胞并在體外進行受精，從而將受精卵與顯微注射、轉染等操作體系配合。而禽類的生殖方式決定了受精卵在離開母體之前，已經經過卵裂等發育階段成為多細胞的胚胎，此外，禽類的蛋殼也加大了對其卵或胚胎進行遺傳修飾操作的難度。

表2 綿羊中使用病毒載體、精子載體或轉座子介導的遺傳修飾研究

1.3 人工核酸酶介導的基因精準編輯

如前面所述，通過顯微注射和體細胞核移植技術，可以實現外源基因的表達或內源基因的打靶，但外源基因的插入是隨機的，打靶的效率也很低。隨著人工核酸酶被證實可以運用于遺傳修飾后，動物的基因修飾已經從最初單一的、隨機性的轉基因向基因組的精準敲入、敲除和點突變快速發展，甚至可以實現時間和組織特異性的基因編輯。目前通過顯微注射和SCNT結合常用的人工核酸酶技術獲得基因編輯綿羊的方法如圖3所示，所報道獲得的基因編輯綿羊如表3所示。

1.3.1 ZFN介導的基因編輯

Lee等[8]于1989年首次報道了鋅指結構，后來逐漸發展為可用于基因編輯的鋅指核酸酶技術。ZFN系統通過序列識別結構域和切割結構域發揮作用。其中，鋅指蛋白由Cys2-His2蛋白單元組成，可以與基因序列上的3個堿基識別[65]。根據靶基因序列，將多個蛋白單元串聯組裝而成的鋅指蛋白即可對其識別，串聯結構越長，就越有識別的特異性[66]。起切割作用的為I酶，在鋅指蛋白的引導下切割基因序列[67]。而I通常形成二聚體，因此可以對序列造成雙鏈斷裂，進而啟動基因修復機制[68]。帶有ZFN表達元件的質粒載體正是通過這種機制對細胞基因組進行編輯。ZFN首次在非洲爪蟾()中被應用[12]，此后在果蠅()[69]等動物中均被成功使用。

圖3 人工核酸酶技術制備基因編輯綿羊的方法示意圖

ZFN、TALEN或Cas9載體主要通過顯微注射或體細胞核移植遞送入體細胞或受精卵中，在細胞中介導DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break, DSB)，經過細胞內同源重組修復(HDR)或非同源末端連接(NHEJ)修復可以對內源基因進行編輯或引入外源基因，獲得的基因編輯細胞經過體細胞核移植(SCNT)獲得后代，基因編輯胚胎則通過胚胎移植入受體中獲得后代。

表3 人工核酸酶技術介導的基因編輯在綿羊遺傳修飾中的應用

Salabi等[14]在綿羊肌肉衛星細胞中通過ZFN對進行了編輯并篩選獲得了陽性克隆，繼而驗證在衛星細胞中的功能。Zhang等[47]在綿羊成纖維細胞中成功敲除了基因，并通過ZFN mRNA的顯微注射獲得了基因編輯胚胎。但目前未見有通過ZFN獲得基因編輯綿羊的報道。ZFN的使用比被動的同源重組在效率上有了較大的提高，但由于其設計復雜、特異性較差、有細胞毒性以及容易脫靶等原因，逐漸被后來的其他人工核酸酶所取代。

1.3.2 TALEN介導的基因編輯

轉錄激活因子樣效應物核酸酶是在植物病原體黃單胞菌()中發現的轉錄激活樣效應物的基礎上建立的[11]，其結構和原理與ZFN相似，包括具有識別功能的TALE蛋白和切割功能的I酶。TALE具有結合DNA的功能，其中含有的重復串聯區域包含34個氨基酸，第12和13位點的氨基酸對于識別特定的堿基起關鍵作用[70]。在TALE導向下，I對基因組的特定區域進行切割。TALEN以二聚體的形式發揮雙鏈切割作用，因此通常制作1對TALEN載體。自TALEN運用到果蠅中以來[13]，在綿羊中的應用主要靶向綿羊基因。通過TALEN mRNA注射受精卵[15]，或體細胞核移植均獲得了編輯綿羊，且在表型上與野生型呈現差異[48,49]。相比ZFN，TALEN在特異性方面有所提高，但TALE分子較大、制備依然復雜，需要的成本和時間過長。

1.3.3 CRISPR/Cas介導的基因編輯

CRISPR/Cas系統憑借其簡單的設計、更高的效率，為基因編輯帶來了革命性的突破。CRISPR全稱為成簇的、規律間隔的短回文重復序列。Cas為CRISPR相關基因編碼的特異切割DNA分子的核酸酶，于1987年在細菌和古細菌中被發現，具有發揮細菌免疫功能的作用[7]。CRISPR/Cas系統分為I、II和III，其中Cas9屬于II型系統，僅需要一種蛋白參與即可完成序列切割[71]。II型系統包含4種分子，其中crRNA和tracrRNA組成的雙鏈復合體引導Cas9蛋白在序列上特定位置切割。在實際應用中，通過4個堿基將crRNA和tracrRNA連接，形成向導RNA (single-guide RNA, sgRNA)表達框。一個Cas9載體包含了sgRNA表達框和Cas9蛋白。由于生物體內含有RNase，只需要將20 bp的sg序列連入載體中，就能獲得可以在細胞內切割DNA序列的全部元件，sg序列則為切割提供引導。sg序列雖然依賴于相鄰的PAM序列(5?-NGG-3?序列)，但在基因組中，NGG序列普遍存在，平均每128 bp序列中就可以找到一個位點[71]。CRISPR/Cas系統在2013年被證實可用于哺乳動物的基因編輯，此后使用CRISPR/Cas9進行動物基因編輯的研究出現井噴式的成果。利用顯微注射技術，可以實現Cas9 mRNA及其sgRNA同時被注入受精卵中，獲得基因編輯的綿羊。Crispo等[17]和Han等[50]利用該方法分別獲得了編輯的綿羊，其與野生型綿羊相比表現出明顯的體重差異。Wang等[51]則獲得了多個基因(和)同時編輯的綿羊，顯示出Cas9系統的強大編輯能力。此外，通過Cas9系統結合顯微注射獲得了[52]及[53]基因編輯綿羊。另外，還實現了綿羊Rosa26位點的外源基因定點插入[54]。CRISPR系統也可以與SCNT技術結合制備基因編輯綿羊，如對基因編輯的綿羊[55]以及編輯的綿羊[56]。

1.3.4 單堿基編輯系統(base editing)

2016年，Komor等[72]開發了基于Cas9系統的單堿基編輯系統，該技術被評為雜志年度十大科學技術突破之一，在基因治療、遺傳育種等領域具有應用的潛力。通過將失活或只有單鏈切割活性的dCas9 (deactivated Cas, dCas)及nCas9 (nickase Cas, nCas)與嘧啶或嘌呤脫氨酶結合，單堿基編輯器可以精準的將胞嘧啶(C)轉化為胸腺嘧啶(T)，或將腺嘌呤(A)轉化為鳥嘌呤(G)，分別稱之為胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editors, CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABE)[73]。單堿基編輯器不需要依賴基因組雙鏈斷裂的產生，也無需供體DNA參與編輯，因此簡化了基因編輯步驟。在綿羊中，Zhou等[57]通過CBE系統實現了基因的C>T轉換，獲得了具有更快生長速度的基因編輯灘羊，為培育快長型綿羊品系奠定了基礎。單堿基編輯系統將動物的遺傳修飾從最初的整個基因的插入或大片段的敲除縮小到單個堿基的操作水平，對動物中由單堿基突變導致性狀變異的位點進行基因編輯。但單堿基編輯系統目前僅可以實現堿基的轉換(transition)而無法實現堿基的顛換(transversion)，只能對符合堿基轉換類型的特定突變進行編輯，限制其對任意性狀的操作。此外，Jin等[74]及Zuo等[75]分別在不同物種中發現單堿基編輯系統存在嚴重的脫靶效應，應用時可能存在較大風險。其中，Zuo等[75]還建立了名為GOTI (genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection)的脫靶檢測技術，能夠顯著提高單堿基編輯時脫靶檢測的敏感性，可以在全基因組范圍內發現以往檢測手段不易發現的脫靶位點。該方法為減少單堿基編輯技術應用的風險提供保障，利于該技術的廣泛應用。

目前，除Cas9及單堿基編輯系統外，還有多種CRISPR相關的基因編輯工具被開發出來。例如，具有更高編輯效率的Cas12系統，具有靶向RNA編輯功能的Cas13系統，能夠編輯單鏈DNA的Cas14系統[76]以及更小分子量的CasⅩ[77]等。除Cas9之外，目前尚未見到其他CRISPR/Cas系統在綿羊中應用的報道，但這些研究為綿羊的分子育種提供了較新的思路和方法。

2 利用遺傳修飾在綿羊中進行分子設計育種的主要方向

在馴化初期，人類飼養綿羊作為主要肉類來源，因此馴化方向大多為肉用品種。此后，為了獲得羊毛等副產品，人們又馴化出產毛量、毛色各異的地方綿羊品種。經過長期的人工馴化，現在的綿羊品種與其祖先在體型外貌、行為、生殖能力等方面顯示了巨大差異，并在品種間出現顯著變異。人工選擇會在基因組上留下與動物性狀相關的選擇信號或分子標記。通過遺傳修飾在綿羊中進行分子育種，不僅使育種時間大為縮短，也可以將多種優良性狀聚合，一次實現多個性狀的改良。在綿羊中，通過遺傳修飾進行分子設計育種主要體現在增強抗病抗逆能力，包括抗病毒、細菌及寄生蟲能力和抗寒、抗高溫高濕能力；改良生產性狀，包括肉產量、肉品質、奶品質；改善羊毛產量和品質，包括毛長度、產量和強度；提高繁殖力，包括排卵數和產羔數等方面；制備動物模型，包括人類疾病模型或制備藥品等。利用遺傳修飾在綿羊中進行分子設計育種的應用方向如圖4所示。

2.1 通過分子設計育種改善羊毛性狀

從克隆羊多莉出生到現在的20多年間，國內外針對上述性狀開展了多項遺傳改良方面的研究。在提高羊毛性狀方面，Damak等[26,78]獲得的轉基因綿羊F1代的羊毛產量提高了6.2%，但F2代的羊毛產量提高效果卻不顯著。Bawden等[28]將毛角蛋白II基因在皮質中特異性表達，獲得的轉基因羊毛結構發生改變，外觀富有光澤且卷曲度下降。多項獲得基因編輯綿羊的研究都證實轉基因個體羊毛產量比野生型綿羊有顯著提高[38,45]。Zhang等[58]通過顯微注射和Cas9技術敲除了基因獲得毛色發生變化的基因編輯綿羊。He等[34]通過睪丸注射進行基因編輯也獲得了毛色變化的綿羊。

2.2 通過分子設計育種改變肉產量及品質

在改善綿羊產肉量及肉品質方面是研究者投入精力最多的領域。Amdas等[19]獲得的轉生長激素基因綿羊可過量表達生長激素，使生長速度增加同時減少脂肪含量。牛生長激素[21]以及人生長激素[6]都曾被轉入綿羊中以提高綿羊生長速度。在提高產肉量方面，基因是大部分研究者選擇的靶基因。敲除的綿羊大部分能獲得生長速度較快、體重顯著增加以及肌纖維增大的表型。Proudfoot等[16]、Crispo等[17]、Hu等[45]、Zhao等[48]、Li等[49]、Han等[50]以及Zhang等[56]通過TALEN或Cas9等方法結合顯微注射或體細胞核移植獲得了敲除綿羊，且取得預期表型。通過Cas9介導的基因單堿基編輯綿羊同樣表現出顯著提升的生長速度[57]。綿羊肉品質的改良主要集中在減少肌間脂肪含量和改善脂肪成分方向，主要通過導入外源基因和對脂肪代謝相關通路中成員進行編輯來實現。目前，已獲得了[35]、[36]和[33,79]的轉基因綿羊。

圖4 利用遺傳修飾在綿羊中進行分子設計育種的應用方向

通過對性狀相關的基因進行修飾，在綿羊中可以實現多個方向的應用，例如生產性狀，包括肉產量、肉質、生長速度等；毛纖維性狀，包括羊毛產量、結構、毛色等；繁殖性狀，包括產羔數等；高抗病能力；制備人類疾病模型；通過乳腺反應器生產藥物等。

2.3 通過分子設計育種進行綿羊抗病及疾病模型研究

抗病育種研究主要包括針對病原體進行干擾、針對內源病原體受體進行敲除、轉入具有病毒抗原的基因以及誘導動物體內產生抗體4個方面。Denning等[30]通過基因敲除獲得了4只單等位基因敲除綿羊。Clements等[20]制備了轉入羊髓鞘脫落病毒核衣殼蛋白基因的綿羊，在該綿羊血液中檢測到了vvENV糖蛋白的抗體。Deng等[80]通過睡美人轉座子將口蹄疫病毒VP1蛋白轉入綿羊中，轉基因綿羊在體外攻毒實驗中表現出抗病能力。此外，基因也被轉入綿羊中獲得具有抗病能力的轉基因綿羊[32]。

在生物醫藥或人類疾病模型制備方面，主要包括綿羊乳腺生物反應器制備藥物或建立人類疾病模型綿羊。從20世紀90年代起，出現了多個轉人凝血因子綿羊的報道，并可以在綿羊乳腺中獲得人凝血因子，用于治療血友病等血液疾病。2000年，McCreath等[31]將人α-1-抗胰蛋白基因定點整合在綿羊的基因中，獲得了首例基因打靶綿羊。人突變體轉基因綿羊的建立為人亨廷頓舞蹈癥的研究提供了疾病模型[27,46]。在動物疾病模型領域，Denning等[30]獲得的敲除綿羊為異種器官移植的研究奠定了基礎。Williams等[52]將基因進行編輯，獲得了模擬人HPP (Hypophosphatasia)綜合征的綿羊模型。Vilarino等[53]獲得了基因敲除綿羊，同樣出現胰腺缺失的表型。Fan等[56]獲得的基因編輯綿羊，表現出與人囊性纖維化相似的表型。Menchaca等[61]將突變型通過Cas9介導的單鏈同源重組轉入綿羊中，獲得了耳聾模型的綿羊。Ma等[64]將褪黑激素(melatonin)基因轉入綿羊中，獲得了在乳腺中表達褪黑激素的轉基因綿羊。

2.4 通過分子設計育種改善綿羊繁殖性能

綿羊的繁殖性狀是羊實際生產中最受關注的性狀。影響綿羊產羔的主效基因為，即骨形態發生蛋白BMPR1B在A746G位置發生了氨基酸突變，該突變能顯著提高綿羊的產羔能力[59]。目前已有Cas9介導的基因編輯綿羊[59,60]，但其后代的產羔表型還未見報道。

除上述獲得的已知功能的基因修飾綿羊，還有部分綿羊中定位清晰但功能不完全明確的主效基因，也可做為后續基因編輯的研究對象，如與產羔數相關的(bone morphogenetic protein 15)、(growth differentiation factor 9)等[81]；與綿羊椎骨數相關的(vertebrae development homolog)基因[82]；與改善肉質相關的(melanocortin-4 receptor)基因[83]和(fatty acid-binding protein 4)[84]等。目前已經在綿羊中開展遺傳修飾研究的基因及其相關功能見表4。這些研究為綿羊分子設計育種提供了可行的思路。

近年來，我國肉羊規模化養殖比例一直在提升，隨著養殖方式的轉變，生長快、繁殖能力強且飼料轉化率高的舍飼肉羊品種將會愈發受市場認可。但生長、繁殖以及代謝這些性狀均為多基因控制復雜性狀，如何在傳統育種理論基礎上更好引入分子育種概念是需要探索的。一方面針對這些重要經濟性狀的部分功能明確的主效基因，可直接利用以上的遺傳修飾方法快速獲得性能突出的基因編輯動物做為育種新材料；另一方面對于目前尚不確定的功能位點，可以通過這些遺傳修飾手段直接在目標動物中驗證功能位點的有效性，進一步促進育種過程中分子標記輔助選擇的準確度。

與豬()相比，綿羊中進行遺傳修飾的研究無論在數量和質量上都比較低。其原因首先在于兩個物種的養殖數量和研究重要性方面差距較大；其次從技術層面，豬為多胎動物且養殖規模較大，卵母細胞相對容易獲得，體外培養體系更成熟，且細胞對體外環境的耐受性更好；另外豬的遺傳修飾模型除了涉及畜牧業，還常作為疾病模型或器官移植來源延伸到醫學研究領域，因此更多的團隊以豬為研究對象。相比較而言，綿羊繁殖能力低于豬，較難獲得大量的卵母細胞。目前在綿羊中進行遺傳修飾操作的目的主要為品種遺傳改良，在疾病模型等領域研究較少。但是，綿羊也是醫學中神經生物學以及脊柱發育研究等方面的良好研究對象，未來的綿羊分子設計育種研究也可以更多的應用于建立醫用模型。

表4 重要性狀基因在基因修飾綿羊中的研究

3 遺傳修飾技術在綿羊中應用的問題及展望

分子設計育種代表著未來種業的發展方向，近年來在遺傳修飾技術方面發展迅速，但總體看來家畜分子育種尤其是綿羊分子育種的研究還處于初級階段，距離商業化以及實際生產還有較長路要走。其中的問題主要包括功能基因研究不夠明確，生產效率低且成本高，生產周期長以及較難通過生物安全評價等。

3.1 功能基因選擇和表達調控研究不夠明確

分子生物學和基因組學研究經過幾十年的迅猛發展，已經取得了矚目的成就，但是對于畜禽大動物尤其是綿羊而言，由于基因組的解析、基因功能的挖掘以及基因表達調控模式探究等方面的研究遠遠落后于人類以及模式動物，只有極少數性狀被定位到了致因突變并闡明了遺傳機理。而且綿羊和其他家畜的重要經濟性狀大多為數量性狀，這類性狀存在多基因協同或拮抗表達或者存在印記效應等，導致遺傳操作的難度較大。傳統的轉基因方法的隨機插入可能造成表達不穩定，影響其他基因的表達；生長相關基因敲除或突變，會造成動物癱瘓或器官發育異常；繁殖相關基因突變，會造成母畜不育或難產等。這些問題僅通過革新基因編輯技術并不能從根本上解決。在畜禽大動物上，可以通過可靠的遺傳資源群體、準確的表型數據測定并結合現有的大數據進行遺傳定位分析，同時利用分子生物學手段解析致因基因及突變的調控機理，最終利用合理的基因編輯手段獲得分子設計個體。但這個過程周期長且耗費大，需要團隊合作。目前，已發現的可能影響綿羊表型的基因及其相應的功能突變見表5。

3.2 制備遺傳修飾動物的生產效率低且成本較高

在綿羊、山羊()和豬等大動物中，無論是通過顯微操作技術還是體細胞核移植技術制備遺傳修飾動物，都存在效率偏低的問題。通過顯微注射方法獲得基因編輯個體時，會存在產生的基因編輯個體嵌合現象，即產生的基因編輯后代個體中包含不同的基因型。其原因在于受精卵注射核酸后，沒有立即對胚胎進行編輯，而在胚胎卵裂后才對不同細胞各自進行編輯而產生不同的基因型，因此，應盡快在受精后立即進行顯微注射，以提高胚胎發育早期發生基因編輯的概率，從而降低產生嵌合后代的概率。此外，對注射核酸的總量及濃度也需要優化調整。在綿羊、山羊和豬中通過顯微注射獲得遺傳修飾動物的效率均可達到10%以上甚至更高，而體細胞核移植技術克隆效率低，且去核過程會對細胞質造成較大損傷。通過克隆胚胎獲得基因編輯綿羊、山羊和豬的效率往往不超過5%，實驗獲得綿羊、山羊和豬個體的效率統計見表6。

為了提高遺傳修飾動物的效率，找到引發效率低下的原因是關鍵。不同動物物種之間，影響遺傳修飾的因素以及陽性個體獲得效率存在顯著差異。研究顯示，體細胞核移植制備克隆動物的主要障礙包括移植后胚胎存活率低且容易流產，其主要原因為體細胞重編程過程中的多種表觀修飾障礙。在豬中，(retrotransposon-like-1)的甲基化異常是以豬誘導多能干細胞(induced pluripotent, iPS)為供體時克隆成功與否的重要影響因素，的敲除和代償實驗證明克隆動物的關鍵因素在于的表達是否正常[104]。制備克隆猴()的難點也在于胚胎發育過程中的甲基化修飾，例如存在H3K9三甲基化，當添加了H3K9me3去甲基化酶KDM4D和組蛋白去乙酰化酶HDAC抑制劑TSA后，獲得了世界首例體細胞克隆猴[105]，表明在克隆猴過程中在培養體系中添加表觀遺傳修飾的抑制劑可以提高克隆效率。在克隆猴制備過程中供體細胞的選擇也比較關鍵，使用卵丘細胞做供體的克隆猴出生后不久便死亡，而使用胎兒成纖維細胞做供體時獲得了存活的克隆猴。此外，外源因子對重構胚的發育也有影響。褪黑激素是一種抗氧化劑，具有清除活性氧的作用，通過調節氧化應激，可減少DNA損傷，在體細胞核移植的胚胎發育液中添加褪黑激素等可以提高豬重構胚的發育潛能，進而提高克隆效率[106]。在綿羊中，也有通過在供體細胞培養過程中添加表觀修飾抑制劑KDM4D提高克隆胚胎體外發育能力的報道[107]，表明表觀修飾對動物克隆胚胎發育的影響存在普遍性，通過改善這些影響，可以提高獲得克隆動物的效率。要根本解決克隆效率低的問題，對大動物胚胎發育過程調控方式以及關鍵效應通路等的基礎研究至關重要。

在實驗操作方面，現有的受精卵電轉染系統可以將sgRNA及Cas9的mRNA共轉入受精卵中，并通過Cas9作用對受精卵進行編輯，這是獲得基因編輯動物的簡化方法[108]。顯微操作和體細胞核移植過程需要的顯微操作設備，成本較高，同時需要專門的技術人員操作，增加了培訓和時間成本。對于提供受體動物的實驗場，需要專門預留一定數量的優質后備母羊，在飼養成本上有所增加。

3.3 基因編輯新品種的生物安全評價和應用

通過分子設計育種獲得的家畜要實現商業化所面臨的最大問題為生物安全評價。以CRISPR/Cas系統代表的人工核酸酶介導的基因編輯技術已經成為遺傳修飾的主流方法。我國對基因修飾動植物(包括轉基因和基因編輯)的生物安全評價非常嚴格，目前在我國批準上市的只有抗番木瓜環斑花葉病毒(papaya ringspot virus)的轉基因木瓜()和抗棉鈴蟲的轉基因棉花()。轉基因生物安全主要針對遺傳修飾動植物是否會破壞生態平衡，是否會影響人們的健康等方面進行評價。目前還沒有確切的證據證實基因修飾動植物在生物安全方面有安全隱患。例如轉基因牛產生的重組乳鐵蛋白飼喂小鼠實驗中，長期的飼喂未使小鼠出現顯著的臨床癥狀和行為異常[109]。遺傳修飾生物的排泄物是否會對環境產生威脅也未有定論。即便如此，仍然需要制定完善的評價體系，針對食物毒性、過敏性、抗生素及營養成分代謝等方面進行安全評估。雖然基因編輯技術等遺傳修飾方法在育種應用中受到了爭議，但不可忽視其巨大的應用前景。在有嚴格的生物安全評價為保障基礎上，分子設計育種代表著未來家畜育種的發展方向，能夠促進畜牧業發展。

目前，由于生物安全評價的限制，通過遺傳修飾育種獲得的動物品種目前很難開展大規模的育種研究，更不可能實現商業化。美國食品藥品監督局分別在2009年、2014年和2015年批準了基因修飾山羊、兔()和雞生產的藥物上市，而真正得以進入食品領域的遺傳修飾動物僅為2015年批準的轉生長激素三文魚()和2020年批準的敲除的基因編輯豬。目前批準上市的品種僅僅是眾多研究成果的冰山一角，期望未來有越來越多的分子育種動物產品走進人們的視野。

在綿羊和其他農業動物中，仍然存在大量的遺傳變異位點未被解析。在未來的研究中，需要對適合育種的重要經濟性狀位點進行持續挖掘并結合不斷改進的分子設計育種工具，創制和培育出能夠滿足人們健康生活質量需求的動物新品種。

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Application of genetic modification technologies in molecular design breeding of sheep

Haitao Wang1,2, Tingting Li3, Xun Huang1,2, Runlin Ma1,2,4, Qiuyue Liu1

Genetic modification technologies can be used for modifying animal genome to express exogenous genes or affect the function of endogenous genes. In animal breeding, genetic modification technologies allow the rapid generation of germplasms with beneficial traits. It includes traditional genetic modification, virus or sperm carrier-mediated genetic modification and nuclease-mediated genome editing, especially the CRISPR/Cas9, one of the artificial nuclease genome editing technologies, have been applied in genome editing in many domestic animals including sheep (). Compared with conventional strategies used for animal breeding, there is great value for sheep breeding improvement by using genome editing technology, which is more effective and timesaving. In this review, we summarize the approaches of genetic modification in sheep and discuss the possibility of molecular design and breeding of sheep by genome editing technologies. We also identify the potential bottlenecks and challenges of these technologies in sheep breeding.

sheep; genetic modification; genome editing; animal breeding

2021-03-08;

2021-04-14

中國科學院戰略性先導科技專項(A類)(編號：XDA24030205)資助[Supported by the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No. XDA24030205)]

王海濤，博士，博士后，研究方向：農業動物基因編輯。E-mail: wanght@genetics.ac.cn

馬潤林，博士，研究員，研究方向：免疫功能基因組學與免疫遺傳學。E-mail: rlma@ucas.ac.cn

劉秋月，博士，副研究員，研究方向：肉羊遺傳育種。E-mail: qyliu@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.21-087

2021/5/6 10:33:00

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210430.1638.002.html

(責任編委: 姜雨)