舒肝益脾顆粒質量標準研究*

顏瑞琪，栗建明，顧利紅，侯惠嬋，袁震霆

（廣州市藥品檢驗所·國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，廣東 廣州 510160）

舒肝益脾顆粒由茵陳、蒲公英、五味子、黃芪、茯苓、山楂組方，具有清化濕熱、舒肝利膽、解毒退黃、健脾和胃功效［1］，為肝膽類疾病臨床常用藥。茵陳為方中君藥；五味子中含有木脂素類（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等）、揮發油類和三萜類等活性成分，具有保肝護肝、鎮靜催眠、抗氧化、增強免疫力等藥理作用［2－7］。目前，該品種有 6 家企業擁有批準文號，各企業執行的質量標準均不一致，生產工藝參數、檢驗項目、含量測定指標和限度均有較大差異，包括含蔗糖型和無蔗糖型。由于已有標準中薄層色譜（TLC）鑒別缺乏對茵陳的質量控制，五味子含量測定僅以單一成分為控制指標，質量標準不完善，不能有效控制該品種的質量。近年來，多指標含量測定已廣泛應用于中藥材、中成藥的質量控制［4，8－17］。本課題中采用 TLC 法對茵陳進行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定舒肝益脾顆粒中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量，建立完善的質量標準，為該制劑的深層次開發和質量控制提供可行性方案。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A 型高效液相色譜儀，包括SIL－20AC 自動進樣器、CTO－20A 柱溫箱、SPD－M20A 檢測器和LabSolutions 色譜工作站（日本 Shimadzu 公司）；XP26 型和XS204 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；硅膠G60 薄層預制板（德國 Merck 公司）；Elmasonicp P300H型超聲儀（德國Elma 公司）。

1.2 試藥

茵陳對照藥材（批號為120950－201608），五味子醇甲對照品（批號為110857－201815，含量為99.7%），五味子甲素對照品（批號為110764－201714，含量為99.3%），五味子乙素對照品（批號為110765－201512，含量為99.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；舒肝益脾顆粒（M1 公司，批號為 S1 及 S2；M2 公司，批號為 S3－S7；M3 公司，批號為 S8－S12）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 茵陳 TLC 鑒別

取樣品10 g（含蔗糖型）或2 g（無蔗糖型），研細，加甲醇30 mL，超聲（功率為380 W，頻率為37 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，即得供試品溶液。另取茵陳對照藥材 1.5 g，加水 30 mL，煎煮 60 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，即得對照藥材溶液。另取缺茵陳的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2015 年版《中國藥典（四部）》（通則 0502）TLC 法試驗，在溫度為 20 ℃、相對濕度為58%條件下吸取上述供試品溶液2 ～4 μL 及對照藥材溶液、陰性對照品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯 － 乙酸乙酯 － 丙酮（5 ∶3 ∶2，V ／ V ／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置365 nm 紫外光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同藍色的熒光主斑點。陰性對照無干擾。詳見圖1。

2.2 五味子含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）－ 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫 （0 ～ 15 min 時 56%A，15 ～ 25 min 時 56% →75%A，25 ～44 min 時 75%A）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：217 nm；柱溫：30 ℃。

圖1 薄層色譜圖1.Negative reference solution 2.Reference medicinal materials solution 3 － 14.Test solution（batch number：S1 － S12）Fig.1 TLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取3 種對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲50 μg、五味子甲素10 μg、五味子乙素15 μg 的混合對照品溶液。取裝量差異項下供試品，研細，取約 5.0 g（含蔗糖型）或 1.0 g（無蔗糖型），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過；精密量取續濾液25 mL，蒸至近干，殘渣加甲醇使溶解，并移至5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。取缺五味子的陰性樣品（企業提供），按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.2.2 項下3 種溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，陰性對照無干擾。理論板數按五味子醇甲峰計應不低于3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖2。

線性關系考察：取3 種對照品適量，精密稱定，加甲醇，制成五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素質量濃度分別為 0.250 6，0.125 2，0.168 9 mg ／mL 的混合對照品貯備液，稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，注入高效液相色譜儀，依法測定。以各成分峰面積為縱坐標（Y）、進樣量為橫坐標（X，ng）進行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。

精密度試驗：取已知質量濃度（五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素質量濃度分別為 49.790，9.985，14.964 μg ／mL）的對照品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的 RSD 分別為0.03%，0.09%，0.08%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖1. schisandrol 2.schisandrin A 3. schisandrin BA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

表1 線性關系考察結果（n ＝10）Tab.1 Results of linear relation test（n ＝ 10）

穩定性試驗：取樣品1.0 g（無蔗糖型，批號為S7）或5.0 g（含蔗糖型，批號為S12），依法制備供試品溶液，分別在室溫下放置 0，4，8，16，24，30，36 h 時按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的 RSD 均小于 1.00% （n ＝ 7），表明供試品溶液在室溫下36 h 內穩定。

重復性試驗：取樣品1.0 g（無蔗糖型，批號為S7）或5.0 g（含蔗糖型，批號為S12），依法平行制備供試品溶液各6 份，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果無蔗糖型樣品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量分別為 0.564 3，0.090 7，0.141 4 mg ／g，RSD 分別為 1.40% ，1.40% ，1.50% （n ＝6）；含蔗糖型樣品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量分別為0.127 9，0.061 6，0.087 8 mg ／g，RSD 分別為 0.67% ，1.51%，1.48%（n ＝6）。表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品約0.5 g（無蔗糖型）和 2.5 g（含蔗糖型），各 6 份，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液50 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.2.4 樣品含量測定

取12 批樣品，每批取1 袋，依法制備供試品溶液，進樣測定，以外標法計算含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg／袋，n ＝2）Tab.3 Content determination of schisandrol，schisandrin A and schisandrin B in the samples（mg ／bag， n ＝ 2）

3 討論

茵陳為舒肝益脾顆粒方中君藥，但目前各企業現行標準中均無該藥材的鑒別項目，2015 年版《中國藥典（一部）》中所載茵陳分為綿茵陳和花茵陳。前期調研結果顯示，生產企業均使用綿茵陳投料。參考生產工藝，對照藥材采取水煮后醇提的處理方法，盡量保持與生產過程一致。同時，還考察了不同廠家的薄層色譜板（青島海洋硅膠G 板、山東煙臺硅膠G 板和默克硅膠 G60板），不同溫度（5，20，30 ℃ ），不同相對濕度（32%，58%，88%）對結果的影響。結果顯示，在色譜板、溫度、相對濕度發生一定變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

預試驗中分別考察了提取方法（超聲提取、回流提取），提取溶劑（體積分數為100%、75%、50%的甲醇和三氯甲烷），提取時間（30，45，60 min）對 3 種木脂素類成分提取率的影響。結果顯示，以甲醇超聲提取30 min 的效率較高，且提取時間適宜，故最終選擇此方法制備供試品溶液。

2015 年版《中國藥典（一部）》五味子含量測定項下檢測波長為250 nm，故本試驗中采用二極管陣列檢測器，在 190 ～ 400 nm 波長范圍進行掃描，結果顯示，3 種對照品在217 nm 和250 nm 波長處均有最大吸收，但五味子甲素、五味子乙素在250 nm 波長處響應值較弱，故最終選定217 nm 作為檢測波長。

由于現行標準各企業所控制的成分各不相同，所測成品中五味子相應成分含量差異較大。本研究中建立的HPLC 法可用于同時測定舒肝益脾顆粒中3 種木脂素類成分含量，該方法較現行標準增加了五味子的指標成分數量，有利于對五味子原料質量的全面控制，設立統一的監測指標并評價該品種質量的一致性。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡便，準確度和精密度高，重復性和穩定性好，可用于舒肝益脾顆粒中茵陳的薄層鑒別，以及五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3 種木脂素類成分含量的同時測定，可為舒肝益脾顆粒質量標準的建立提供參考。