基于玉米根系圖像的表型指標獲取方法

王傳宇，郭新宇，溫維亮，吳 升，顧生浩

基于玉米根系圖像的表型指標獲取方法

王傳宇，郭新宇※，溫維亮，吳 升，顧生浩

（1. 北京農業信息技術研究中心，北京 100097；2. 國家農業信息化工程技術研究中心，北京 100097；3. 數字植物北京市重點實驗室，北京 100097）

為了快速獲取玉米根系表型指標，該研究提出一種基于圖像的高通量解決方案。系統整合一套簡易可靠的根系圖像獲取硬件和自動化根系圖像處理算法，首先在固定背景下獲取玉米根系圖像，通過標定物檢出、背景分割算法得到根系目標前景圖像，識別根系起始點并剪除冗余部分得到根系感興趣區域后計算顏色、形狀、空間分布3大類29個表型指標。應用該系統獲取135個玉米自交系材料吐絲期根系圖像和表型數據，其中根系分支角度指標與人工測量值回歸分析的決定系數為0.85，驗證了系統的精度和準確性。采用非監督聚類方法對135個自交系材料根系表型指標分類，獲得3種根系形態類型，通過剖面圖分析了各指標在分類中的作用以及不同類型根系的主要表型差異。該方法能夠快速獲取多個玉米根系表型指標，滿足了大規模種質資源鑒定和商業化育種對表型數據的需求。

圖像處理；根系；機器視覺；表型；高通量；玉米

0 引 言

根系是植物重要結構功能器官，對地上部分起到支持固定作用，是水分和氮素等營養進入植物的主要通道，是某類生長調節激素的重要合成場所[1-4]。根系物理和生理功能的發揮，主要受到根系系統結構（Root System Architecture，RSA）的影響，RSA被定義為根系的外部輪廓形狀和根系內部的空間排布特征，由基因型和外部土壤環境交互作用決定[5-9]。可以通過根系的表型指標描述RSA，例如根數量、長度、直徑、側根分支角度等，定量化獲取根系表型，為研究根系的氮素高效吸收、作物抗倒伏、節水抗旱提供關鍵根系構型數據支持，從而緩解環境變化和耕地減少對糧食增產的壓力[10-14]。

土壤是不透明的固體，這造成根系表型獲取難度大大高于地上部器官，成為理想株型育種和功能基因組研究的主要瓶頸[15-16]。近年來，隨著相關領域技術裝備的發展涌現出一系列根系表型獲取方法，如基于探地雷達和X射線斷層掃描的原位測量技術，通過根系和介質對特定波長電磁波的吸收差異，三維重建根系結構，受限于植物含有的水分對電磁波吸收的影響，其精度不高適用范圍不廣，另外高昂的造價也限制其應用[17-18]。微根管方法適合長期定位觀測根系生長狀況，受到根管埋入土壤數量和位置的限制，很難獲得根系全貌信息[19-20]。挖掘組學方法在實踐中應用最為廣泛，通過機械外力將半徑20 cm和深度20 cm的根系挖掘出土，然后振動、噴淋等方式將土壤從根系剝離，最后采用人工測量、拍攝圖像并解析計算、三維掃描重建等不同手段獲取根系表型[21-22]。其中基于圖像的根系表型獲取方法，具有快速、準確、成本低等優勢，近年來被廣泛和深入的研究。Grift等[23]搭建定制化的根系成像室，通過軟件控制相機獲取根系圖片，使用MATLAB編寫圖像處理程序計算出根系分形維數和分支角度2個表型指標。Bucksch等[24]開發了數字圖像根系特征系統（Digital Imaging of Root Traits，DIRT），將普通圖像獲取設備（數碼相機、手機）在一般環境下獲取的根系圖像通過網頁上傳，經過交互操作后返回計算結果。Colombi等[25]研發了根系挖掘組特征估算器（Root Estimator for Shovelomics Traits，REST）平臺，采用成像帳篷減少外界變化光源對圖像分割的影響，圖像獲取使用消費級的數碼單反相機，圖像分析程序由MATLAB編寫，獲取了12項根系表型特征指標。上述基于圖像的根系表型獲取方法極大提高了RSA分析的信息化、數字化程度，節約了大量人力成本，使得輪廓、空隙等復雜表型計算成為可能。

前人研究雖已經取得較大進展，但仍然可從簡化圖像獲取設備增加田間開放環境下的便攜性、開發開源軟件減少用戶使用成本、提取適宜表征玉米群體之間表型差異的表型參數等方面改進。本研究研發了一套適合田間開放環境玉米根系圖像表型獲取硬件設備，開發了基于圖像處理的根系表型獲取算法與軟件，以達到根系圖像獲取過程容易開展，獲取流程規范易操作，獲取的圖像根系表型指標更具代表性和分辨性等目的。為提高玉米根系表型指標獲取的自動化程度，實現自動化表型指標檢測流水線提供技術支撐。

1 材料與方法

根系圖像數據獲取與處理流程如圖1所示，對田間種植的玉米自交系材料，挖掘根系取樣后拍攝圖像，然后進行根系圖像的預處理、根系提取，計算包括顏色、形狀、空間分布的根系圖像表型指標，最后編寫根系圖像表型解析軟件，集成圖像表型解析算法和用戶操作界面。

1.1 試驗設計與數據獲取

北京市農林科學院（39°56′N，116°16′E）試驗田內，種植玉米自交系135個，密度為6株/m2，行距為60 cm，小區長度為10 m，每個自交系種植1行。2018年6月15日播種，五葉期定苗，每穴留1株。播種前深耕15 cm，土壤質地為壤砂土，耕作層田間持水率為35%。耕層其他化學性質包括有機質2.73×104mg/kg，總氮1.37×103mg/kg，有效磷37.5 mg/kg，有效鉀93 mg/kg，土壤pH值為7.7。

玉米植株生長到吐絲期，每個自交系群體中取樣3株，使用挖掘工具取出植株半徑20 cm深度20 cm范圍的根系，抖落粘連不緊密的土壤后，用水沖洗掉剩余土壤，單個根系沖洗時間小于10 min，陰涼處晾干后進行圖像獲取（晾干時間3～4 h）。圖像獲取裝置由相機（日本佳能EOS 5D Mark III，28～75 mm變焦鏡頭）、支架、背景布（藍色）、標定物（光盤）組成（圖2a），獲取圖像時相機使用光圈優先模式，鏡頭焦距28 mm，其他設置保持默認。根系頂端用魚線固定在支架上，獲取根系圖像405張，圖像分辨率為5 760×3 840像素，單張圖像獲取時間小于10 s，圖像示例如圖2b所示。

1.2 根系表型圖像解析方法

圖像表型解析方法包括根系提取、預處理、根系指標計算三部分，所述方法最終整合到根系表型圖像解析（Root Phenotyping Image Analysis，RPIA）軟件中。

1）光盤標定物檢出。藍色背景布前放置3種目標物體，標定物（光盤）、根系、支架。首先將圖像轉化為灰度圖，然后采用固定閾值（200）對灰度圖二值化，獲得一系列光盤候選區域，采用Satoshi-Suzuki算法[26]查找各個候選區域的輪廓，由輪廓點鏈表計算周長（，像素）、面積（a，像素×像素）形狀描述算子Cl，其計算如式（1）所示

Cl =4πa/2（1）

輪廓接近于圓形時Cl值接近1，考慮到根系等自然物體輪廓形狀較難接近圓形，通常小于0.85，故Cl閾值取0.85。標準光盤直徑120 mm，計數圖像中光盤區域像素數量和光盤直徑像素數量，則可獲得圖像中每個像素的實際物理尺寸。

2）背景分割。檢出光盤標定物后，需進一步將根系從背景藍色幕布和黑色支架中分割，考慮到玉米細小節根易誤分割為背景，本研究采用基于支持向量機[27]的像素分類背景分割方法，隨機抽取20張去除光盤標定物的根系圖像作為訓練樣本集，分別在每張圖像選擇50個分辨率為15×15像素的矩形背景和根系區域，計算每個像素的特征值構成分類特征向量（表1），將分類特征向量輸入支持向量機模型訓練獲得像素類別分類器。

使用像素類別分類器對根系圖像分割背景，操作過程中圖像會產生一些不連通區域和孤島像素，根據面積、顏色閾值將該類區域進行濾除與合并。

3）根系起點識別。拍攝根系圖像時為了方便固定，余留部分莖稈區域，后續計算根系表型參數時，需要去除多余的莖稈區域圖像并找到根系開始的原點位置。固定根系時莖稈基本垂直水平地面，故采用掃描線方法從根系圖像頂部逐行獲取莖稈寬度，形成莖稈圖像寬度序列，對序列進行中值濾波（序列中當前位置的前5個相鄰元素和后5個相鄰元素構成的10鄰域的中值）去除可能的噪聲影響，當序列中某個位置寬度數值大于相鄰位置寬度數值的1.5倍時，認為該位置是根系的起點位置。

表1 根系圖像像素分類特征

4）多余根系剪除。在挖掘取根、噴頭沖洗、風干晾曬過程中，難免對根系造成一定損傷，使得下部較細須根系的空間分布、分支角度、空隙排布出現一定異常，這種異常對于表征根系的基因差異和土壤環境特征屬于干擾因素，需按照統一標準剪除。具體方法為：以根系起點為圓心畫圓，圓與根系圖像的交集記為新根系區域，若新根系區域所占像素面積超過原始根系像素面積的90%，則將該新根系區域作為剪除多余根系后的根系區域，若像素面積小于90%則增加圓的半徑，重復上述操作直到滿足條件為止，多余根系剪除后的圖像處理效果如圖3所示。

5）根系分支角度計算。如圖4所示，在圖像中以根系起點為圓心，10 cm為半徑畫半圓，在半圓弧上找到一點，使得扇形2與根系相交的面積與扇形1與根系相交的面積相等，在圓弧1上找到一點1使得扇形1與根系相交的面積為扇形1與根系相交的面積的90%，在圓弧2上找到一點2使得扇形2與根系相交的面積為扇形2與根系相交的面積的90%，則角12即為根系的分支角度。

6）根系凸包計算。凸包被定義為一個實數向量空間中，對于給定集合所有包含該集合的凸集的交集被稱為給定集合的凸包，對于二維平面上的點集，凸包就是將最外層的點連接起來構成的凸多邊形，其可包含點集中所有的點，凸多邊形形狀用來衡量根系圖像的整體形狀。

7）根系空隙。計算根系凸包圖像與根系圖像的“異或”操作，根系的空隙可分為2類即根系輪廓內部空隙和根系輪廓外部空隙（凸包與根系輪廓外部之間）如圖5所示。

注：O為圓心，R1和R2為圓周（直徑為10 cm）上兩點，M為圓周上根系面積等分點，A1為圓弧R1M上90%根系面積分割點，A2為圓弧R2M上90%根系面積分割點。

8）根系緊湊度被定義為根系凸包圖像的形狀描述算子[28]，其計算如式（2）所示

=4πa/p2（2）

式中a為根系凸包的面積，像素×像素；p為根系凸包的周長，像素。緊湊度提供了邊界復雜度的一個簡單衡量指標，如果形狀的邊界越復雜，則值越小，邊界形狀相似的區域具有相似的緊湊度，邊界差異越大緊湊度變化越大，圖像平移、旋轉和縮放不影響值計算結果。

9）根系整齊度定義為根系二值圖像的重心（1階矩）與根系最小外接圓圓心的歐式距離。反映根系中各個組成成分分布的對稱性，對稱性高則根系圖像重心與外接圓圓心距離小，如圖6所示。

注：Om為根系圖像的最小外接圓的圓心，Gr為根系圖像像素坐標的重心點，線段OmGr為根系整齊度。

10）顏色表型指標，根系的顏色隨著根系類型差異呈現一定差別，例如須根較少的根系顏色呈現黃褐，須根較多的根系色彩更為暗沉，地面節根多呈現綠色。為了表征根系表型在色彩上的差異，引入HSV及Lab顏色空間的6個顏色通道，同時計算了深綠指數（Dark Green Color Index，DGCI）[28]如式（3）所示

DGCI=((-60)/60+(1-)+(1-))/3（3）

式中、、為HSI顏色空間的顏色通道分別代表色調、飽和度、亮度。

由根系圖像提取的29個表型指標的具體定義和描述如表2所示。

表2 根系表型指標描述

1.3 根系表型圖像解析軟件開發

根系表型圖像解析軟件（RPIA）的圖形交互界面部分使用開源圖形界面框架Qt 5.10開發，圖像處理使用了開源圖像處理庫OpenCV3.0。軟件功能主要包括1）功能操作：根系圖像導入、檢測標定物、去除背景、輪廓相關表型計算、中間計算過程結果析出、最終結果導出EXCEL表格、根系表型類型分類等；2）計算過程顯示，為了提高計算效率，處理多個根系圖像時軟件采用多線程并行處理方式，某一操作步驟執行進度在該區域顯示，當圖像執行完某個操作且返回正確結果后，對應位置顯示“計算完成”，否則提示相應錯誤；3）圖像結果顯示，某個根系圖像表型計算過程執行完畢后，點擊該行列表圖像位置，圖像結果顯示區域顯示計算過程中生成的關鍵步驟結果，點擊可放大交互瀏覽查看；4）計算結果瀏覽，所有圖像計算操作執行完畢后，點擊“析出結果”按鈕，主要的計算過程數據（包括根系原點坐標、外包矩形大小等）和表型相關數據（根系顏色、形狀、空間分布等參數）即顯示在該區域，單張圖像全部參數計算時間小于4 s。

以EXCEL表格格式導出表2中29項根系表型指標，后續統計分析使用開源統計軟件包R進行（R Studio version1.1.45），線性回歸使用lm函數，主成分分析使用prcomp函數，rashape2用于數據的格式化，數據可視化使用ggplot2包。

2 結果與分析

2.1 根系表型指標統計分布與測量精度

使用根系圖像表型提取算法和軟件，計算獲得135個玉米自交系根系29個表型指標，對數據進行初步統計分析獲得各個表型指標的均值、極值、標準差、標準分數（Z-score）變換后的極值，具體如表3所示。

為了驗證系統的測量精度，選擇人工測量相對容易開展的根系分支角度作為驗證指標，測量方法按照Bucksch等[24]所述根系測量板方法，所得到的人工測量數據與根系表型圖像解析軟件計算結果進行回歸分析（圖 7），其中決定系數為0.85達到極顯著相關性。

2.2 玉米自交系根系系統結構分類

根系表型圖像解析軟件提取的29個表型指標包含根系形狀、顏色、空間分布3大類，為了驗證提取的表型指標區分玉米根系系統結構差異的性能，使用K均值聚類方法（K-means）對135個玉米自交系（每個自交系3個重復樣本）根系表型以29個表型指標為變量進行聚類，K-means是一種非監督聚類方法，通過迭代求解計算K個聚類中心。其中最關鍵的輸入變量是分類的類別數量，本研究中當選擇3個中心進行聚類時，對聚類結果進行主成分分析，第一和第二主成分對分類結果的貢獻率分別為34.3%和19.6%，當聚類中心超過4類時，分類邊界出現重合，為了便于說明29個表型指標的分類效果故選擇3個聚類中心，如圖8所示3個類別具有清晰的邊界。

對于聚類獲得的3類根系結果可繪制出K-means聚類剖面圖（圖9），分別展示出29個根系表型指標在不同類別中的均值分布情況，直觀表達了不同類別表型指標的區別。如圖9所示，1類組中形狀、空間分布指標分布在總體均值附近，大多數顏色指標大于總體均值，而_avg和_avg 兩個指標小于總體均值，甚至小于其他兩類中對應指標數值；2類組中形狀和空間分布指標均大于總體均值，顏色指標數值在總體均值附近；3類組根系中，多數指標小于總體均值。

表3 根系表型指標數值分布統計描述

注：1到405為根系樣本編號。

結合根系圖像分類圖結果可以進一步說明3個類別的差異和分類依據（圖10），使用玉米根系表型圖像分析軟件能夠析出根系圖像分類結果，可以觀察到第1類根系面積、分支角度、空隙等值大小適中，最大特點是氣生根較為發達，表現為顏色指標DGCI_avg、_avg、_avg和_avg等值距離均值差異較大；第2類根系具有較大的面積和分支角度，根系邊緣的空隙多須根豐富，根系造型更為松散緊湊度不高整齊度低；第3類根系面積小、分支角度小、根系的空隙少、氣生根少，根系構型更為緊湊整齊。

上述分類方法使用了全部29個表型指標，根據不同的研究目的可以在分類中使用不同的表型指標組合，例如使用形狀指標對根系的大小形狀分類，使用空間分布指標對根系的空間構型進行分類，使用顏色指標對根系的生理年齡進行分類。進一步可以繪制135種自交系植株根系29個表型指標的層次聚類圖，用以說明形狀、空間分布、顏色3大類表型指標聚類關系和區分效果。

本研究從根系圖像獲取、圖像表型解析算法、根系表型數據分析等3方面給出了基于圖像的玉米根系表型指標高通量獲取及數據分析方案，在此基礎上，根據研究目的的不同可對本文給出的設備、方法、表型指標進行增刪和重組，以適應氮肥高效利用、水分脅迫、作物抗倒伏等方向相關根系表型的研究[29-31]。

3 結 論

本研究以現有植物根系表型圖像解析方法的不足和改進為切入點，

1）搭建了簡易可靠的玉米根系圖像獲取環境，單個樣本圖像獲取時間小于10 s。以開源軟件開發工具為基礎研發了具有友好交互界面的玉米根系表型圖像分析軟件，軟件能夠計算包括形狀、顏色、空間分布在內的3大類29個根系表型指標，單張圖像計算時間小于4 s。

2）對135種玉米自交系材料的根系圖像開展表型指標提取和分析，可以快速獲得大樣本試驗材料表型指標的統計描述結果。通過人工測量方式獲得分枝角度指標與玉米根系表型圖像分析軟件計算結果進行回歸分析后的決定系數為0.85，驗證系統具有較高測量精度。

3）對135種玉米自交系的29個表型指標進行聚類，分析了獲得的3個分類各個表型指標的貢獻差異，并對照根系圖像解釋了分類結果的合理性和正確性。

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Phenotyping index acquisition method based on maize root images

Wang Chuanyu, Guo Xinyu※, Wen Weiliang, Wu Sheng, Gu Shenghao

(1.,100097,;2.,100097,; 3.,100097,)

Due to roots are hidden underground and require considerable effort to characterize, research on plant roots lags behind that of the aboveground organs. This study presented an image-based high-throughput root phenotyping system, which integrated a reliable and simple image acquisition unit and an automatic image analysis software. The hardware platform utilized a blue background cloth to simplify root image content, the tripod was placed in front of the background cloth with a disk marker pasted on its top, root sample bundles with the wishbone of the tripod using a fishing line. A camera (Canon EOS 5D Mark III) with a 28 mm focal length lens faced the background cloth and was focused on the root crown, with aperture-priority model and other settings remain default. Coupled with the optimized image acquisition using the hardware platform, segmentation of the root images from the background required only the Support Vector Machine (SVM) based on the pixel classifying method with a 15-dimensional eigenvector. The contour of a disk marker was roughly spherical, a circularity scoring evaluation function was used to distinguish other compositions according to thresholding of 0.85. Along the stem of the root image, when the width increased up to 1.5 times, the assumed root original point was found. Contaminated data was generated during the sampling process due to root vulnerability nature; a redundant root pruning method was introduced by circular covering beyond 90% of the root area. The root angle of branching was defined as the sum of left and right angles which was calculated by circular covering beyond 90% root area with a 10 cm radius. The convex hull of the root was a polygon, binarization of the root image was the connected domain, the exclusive-or produced gaps within the root region defined as “inner gap” or between the convex and connected domain defined as “gap”. Root uniformity assessment was achieved by evaluating the distance between the center of gravity and the center of the min-enclosure circle of root image pixels. To explain the color difference of roots, introduced 6 channels of Hue Saturation Value (HSV) and Lab color spaces, and a Dark Green Color Index (DGCI) accounted for green degree difference between root images. The software platform was designed to quickly analyze the images acquired using the hardware platform and was to create a simple-to-use and robust program that batch processed a list containing root crown images and output a data file with the measures for each sample in a form convenient for data analysis. A total of 29 phenotyping indices were extracted from each input image, which was stored in a Comma-Separated Values (CSV) text file. Segmented images as well as processed images on which visual depictions of the extracted features were drawn on the intermediate image. Multithread image processing and final phenotyping indices results were visualizations in the computational processing display area. Finally, 29 phenotyping indices of 135 maize inbred lines were available, the preliminary statistical was conducted to describe extreme value distribution. Phenotyping indices measuring accuracy were improved by root angle of branching correlative analysis method between manual measurement and automatic method in this platform, the coefficient of determination between two methods hit 0.85. An unsupervised clustering (K-means) method classified 135 maize inbred lines into 3 classifications, by the aid of a profile chart and root classed results could conclude that phenotyping indices in morphological characters, color features, and spatial arrangement played an important role in the identification of different types. The platform demonstrated in this study that made the high-throughput maize root phenotyping come to be true, with the help of further researches such as selecting a high nitrogen-use efficiency plant according to root phenotyping indices could be done.

image processing; roots; machine vision; phenotyping; high-throughput; maize

王傳宇，郭新宇，溫維亮，等. 基于玉米根系圖像的表型指標獲取方法[J]. 農業工程學報，2021，37(8)：169-176.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.08.019 http://www.tcsae.org

Wang Chuanyu, Guo Xinyu, Wen Weiliang, et al. Phenotyping index acquisition method based on maize root images[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(8): 169-176. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.08.019 http://www.tcsae.org

2020-08-13

2020-10-24

國家自然科學基金項目（31871519）；國家重點研發計劃項目（2016YFD0300605-02）；現代農業產業技術體系專項(CARS-02)；北京市農林科學院改革與發展項目

王傳宇，博士，副研究員，研究方向為基于圖像的作物長相長勢監測。Email：wangcy@nercita.org.cn

郭新宇，博士，研究員，研究方向為數字植物。Email：guoxy@nercita.org.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.08.019

TP391.41

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1002-6819(2021)-08-0169-08