Hsa_circ_0001727在肝細胞癌組織中的表達及與預后的關系

張 燕，齊紅杰

(鄭州大學第一附屬醫院門診，河南 鄭州 450000)

肝細胞癌是世界第四大惡性腫瘤，同時也是全球第三大癌癥死亡原因[1]。肝細胞癌起病隱匿，早期無特異性臨床特征，多數患者在確診時已進展為中晚期，因此，肝細胞癌患者死亡率居高不下[2-3]。近年來，隨著醫學技術的發展，針對肝細胞癌的治療方式越來越多，如經肝動脈化療栓塞、靶向治療及射頻消融術等，在改善患者生存質量、延長生存時間方面取得較好的療效，但仍有部分患者術后復發、轉移或死亡，預后較差[4-6]。而目前臨床尚無可用于評估肝細胞癌患者預后的指標，雖有部分腫瘤生物標志物被用來預測肝細胞癌患者的預后，如癌胚抗原，但其靈敏度較低，預測能力十分有限[7]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類新型非編碼RNA，已有多種cricRNA被證實[8-10]參與肝細胞癌的病理生理進程。然而關于hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者預后的關系并未完全闡明。因此，筆者開展本研究，以期為臨床預測肝細胞癌患者預后提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性選取2015年8月至2016年8月間在鄭州大學第一附屬醫院接受治療的118例肝細胞癌患者作為研究對象。根據《原發性肝癌規范化診治專家共識》[11]中關于肝細胞癌的診斷標準，對疑似肝細胞癌患者進行診斷。納入標準：(1)初次就診并經病理活檢確診為肝細胞癌；(2)入組前未接受放化療、靶向治療等抗腫瘤治療；(3)術后接受規律隨訪；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)伴有其他部位惡性腫瘤；(2)合并重要器官功能不全；(3)發生遠處轉移者。118例肝細胞癌患者中，男性76例，女性42例，年齡47～74歲，平均年齡(63.82±5.74)歲，巴塞羅那(barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期A期78例，B期40例。本研究獲得鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法采用qRT-PCR法檢測肝細胞癌患者hsa_circ_0001727的相對表達量。在無菌環境下將肝細胞癌組織及癌旁組織用剪刀剪碎，用液氮研磨。取研磨液于試管中，4 ℃下4000 r/min離心15 min，取離心后上清液置于EP管中，待測。用TRIzol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠及紫外分光光度計測量RNA的濃度及純度，取總RNA 2 μL加入反轉錄試劑盒中，進行反轉錄反應，合成cDNA，最后PCR擴增。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個循環，72 ℃ 30 s，40個循環。hsa_circ_0001727基因序列正向：5′-GAGGCCCAGCTCAGTGTG-3′，反向：5′-GGCTGCAATGGTCTTGTTGG-3′；以GAPDH為內參，GAPDH正向：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，反向：5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt表示hsa_circ_0001727相對表達量。

1.3 隨訪采用門診及電話等方式對患者進行為期三年的隨訪，了解患者生存情況，每月隨訪1次。起始時間為2015年9月5日，截止時間為2019年9月17日，中位隨訪時間為29個月。

1.4 統計學方法采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據處理。服從正態分布的計量資料用“均數±標準差”表示，肝細胞癌組織及癌旁組織hsa_circ_0001727相對表達量比較采用配對樣本t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料用例或率[n(%)]表示，采用卡方檢驗。用受試者工作特征曲線(ROC)分析hsa_circ_0001727評估肝細胞癌患者預后的價值。采用Kaplan-Meier及Cox單因素及多因素回歸分析影響肝細胞癌患者預后的相關因素。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織與癌旁組織中hsa_circ_0001727相對表達量比較肝細胞癌組織hsa_circ_0001727相對表達量為(0.87±0.32)低于癌旁組織(1.39±0.42)，差異具有統計學意義(t=10.584，P<0.001)。

2.2 hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者臨床病理特征的關系hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者性別、年齡、體質量指數、腫瘤直徑、HbsAg及病灶位置無關(P>0.05)；而與BCLC分期、病灶數目、分化程度有關(P<0.05)，見表1。

表1 hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者臨床病理特征的關系

2.3 hsa_circ_0001727評估肝細胞癌患者預后的效能118例肝細胞癌患者1～3年生存率分別為84.75%(100/118)、75.42%(89/118)和68.64%(81/118)。死亡組患者hsa_circ_0001727相對表達量為(1.16±0.28)低于生存組(1.51±0.41)，差異具有統計學意義(P<0.001)。hsa_circ_0001727評估肝細胞癌患者預后的AUC、敏感度、特異性、最佳截斷點分別為0.811[95%CI(0.72，0.877)]、94.59%、64.20%、1.45，見圖1。

圖1 hsa_circ_0001727評估肝細胞癌患者預后的ROC曲線

2.4 影響肝細胞癌患者預后的因素將性別(女=0，男=1)、年齡(<65歲=0，≥65歲=1)、體質量指數(<24 kg/m2=0，≥24 kg/m2=1)、腫瘤直徑(<5 cm=0，≥5 cm=1)、HbsAg(陽性=0，陰性=1)、BCLC分期(A期=0，B期=1)、病灶數目(單發=0，多發=1)、病灶位置(單側=0，雙側=1)、分化程度(高、中分化=0，低分化=1)、肝動脈化療栓塞(是=0，否=1)、hsa_circ_0001727作為自變量，將肝細胞癌患者預后情況(生存=0，死亡=1)作為因變量納入Cox單因素回歸分析，結果顯示分化程度、肝動脈化療栓塞及hsa_circ_0001727可能與肝細胞癌患者預后存在關聯。按納入標準α≤0.10，將上述因素納入Cox多因素分析，結果顯示肝動脈化療栓塞及hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者預后密切相關，見表2。

表2 影響肝細胞癌患者預后的Cox回歸分析

3 討論

肝細胞癌具有惡性程度高，死亡率高的特點[12-13]。早期發現和早期治療是改善肝細胞癌患者預后的關鍵。此前，有研究利用腫瘤標記物預測肝細胞癌患者預后，如甲胎蛋白，但其敏感度較低[14]。因此，尋找新的生物標志物來替代或聯合甲胎蛋白等指標用于臨床預測患者預后顯得尤為迫切。目前，關于hsa_circ_0001727在腫瘤中的作用已有初步探索，然而目前未見關于hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者預后的報道。因此本研究就hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者預后的關系進行探討。

本實驗比較了肝細胞癌組織及癌旁組織中hsa_circ_0001727的相對表達量，結果顯示肝細胞癌組織中hsa_circ_0001727相對表達量低于癌旁組織，表明hsa_circ_0001727可能參與肝細胞癌的發生過程。通過分析hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者臨床病理資料的關系發現，hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者BCLC分期、病灶數目、分化程度有關，提示hsa_circ_0001727可能與肝細胞癌病程發展存在關系。通過對患者進行為期三年的隨訪，了解到肝細胞癌患者1～3年的生存率分別為84.75%、75.42%、68.64%，與劉愛祥等[15-16]研究結果相似。通過比較不同預后患者hsa_circ_0001727的相對表達量，發現死亡組患者hsa_circ_0001727相對表達量低于生存組患者，提示檢測hsa_circ_0001727相對表達量可能有助于預測肝細胞癌患者的預后情況。因此，筆者構建了hsa_circ_0001727預測肝細胞癌患者預后的ROC曲線，結果顯示hsa_circ_0001727預測肝細胞癌患者預后的AUC為0.827，表明hsa_circ_0001727預測肝細胞癌患者預后的效能較高。為明確hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者預后的關系，筆者采用Cox回歸分析影響肝細胞癌患者預后的因素，發現肝動脈化療栓塞、hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者預后密切相關，結果與既往研究[17]相符。

細胞實驗證實，hsa_circ_0001727可調節生存素的表達水平[18]。生存素是凋亡抑制因子家族成員，其可參與調控細胞的死亡過程，抑制腫瘤細胞的凋亡，使細胞的程序性死亡過程減弱，造成細胞凋亡減少、增殖活性增強，進而導致腫瘤體積增大[19]。此外，生存素還具有抑制半胱氨酸蛋白酶-3的作用，半胱氨酸蛋白酶-3是促凋亡因子激活的重要蛋白酶，其在細胞早期凋亡中起到關鍵作用。活化的半胱氨酸蛋白酶-3可特異性降解細胞蛋白和核糖聚合酶，進而促進腫瘤細胞DNA損傷并抑制腫瘤細胞生長[20]。因此筆者推測hsa_circ_0001727可能通過調節生存素的表達參與肝細胞癌的疾病進展。

綜上所述，hsa_circ_0001727與肝細胞癌患者預后密切相關，檢測hsa_circ_0001727表達情況有助于預測肝細胞癌患者預后。本研究仍存在一定不足，下一步將繼續開展基礎研究，分析hsa_circ_0001727影響肝細胞癌患者預后的病理生理機制。