急性缺血性腦卒中患者血漿miR let-7b-3p水平及意義

張彩玲

(平頂山市第二人民醫院急診科，河南 平頂山 467000)

腦卒中因其高發病率、高致死率及高致殘率而受到國內外臨床研究人員的關注[1]。急性缺血性腦卒中約占所有腦卒中患者的80%，最新研究顯示，我國急性缺血性腦卒中發病率約為1.5%，每年新增卒中患者1643/10萬人[2]。急性缺血性腦卒中發病迅速，易造成患者神經功能損傷及腦組織死亡。因此，急性缺血性腦卒中的防治工作備受臨床醫師的關注。急性缺血性腦卒中的病情發展是由脂質代謝、糖代謝紊亂等多種因素共同作用的結果[3]。此前有研究應用超敏C反應蛋白、白介素-6及紅細胞分布寬度等預測急性缺血性腦卒中患者預后[4-5]，但上述指標易受外界因素的影響，如炎癥、貧血等因素，因此特異性均較低，預測價值十分有限。動物試驗表明，miR let-7b-3p在頸總動脈閉塞引起的急性缺血性腦卒中大鼠中表達升高，并可通過調節熱休克蛋白70的表達參與大鼠急性缺血性腦卒中過程[6]，然而關于miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預后的關系未見報道。因此筆者開展本研究，以期為臨床評估急性缺血性腦卒中患者預后提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2016年5月至2019年5月平頂山市第二人民醫院收治的355例急性缺血性腦卒中患者作為研究對象。參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[7]對急性缺血性腦卒中進行診斷。納入標準：(1)符合急性缺血性腦卒中診斷標準；(2)接受早期溶栓治療；(3)無阿司匹林或氯匹格雷禁忌癥；(4)接受隨訪；(5)首先確診為該病且入組前未接受相關治療；(6)簽署知情同意書。排除標準：(1)伴有惡性腫瘤；(2)伴有嚴重主要臟器功能不全者；(3)既往接受顱腦手術史；(4)凝血功能障礙者；(5)腦出血者；(6)短暫性腦缺血發作者；(7)合并造血系統疾病或存在出血傾向者。355例急性缺血性腦卒中患者男性209例，女性146例，年齡42～75歲，平均年齡(56.62±7.20)歲，TOAST病因學分型大動脈粥樣硬化性152例、小動脈閉塞性75例、心源性栓塞70例、病因未明確58例。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集入選病例的性別、年齡、吸煙、體質量指數(body mass index,BMI)、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、病灶數目、急性卒中Or910172治療試驗(TOAST)病因學分型、發病-治療時間(onset-to-treatment time,ONT)、出血轉化等。采用酶聯免疫法檢測白介素-10、同型半胱氨酸、D-二聚體水平；利用全自動生化分析儀檢測糖化紅蛋白水平。

1.2.2 血清學指標 抽取入組患者空腹外周靜脈血10 mL，室溫下4000 r/min離心15 min，分離血清與血漿，置于-20 ℃冰箱，待測。采用實時熒光定量PCR法(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測血漿miR let-7b-3p相對表達量，Trizol試劑(賽默飛飛世爾)提取的血漿中的總RNA，將2 μg的總RNA添加至20 μL反應液中，采用PrimeScript逆轉錄酶(寶生物工程(大連)有限公司)反向轉錄合成cDNA；PCR擴增。反應條件為：94 ℃ 5 min(變性)，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 30 s，35個循環(延伸)。miR let-7b-3p正向：5′-CUAUAUAGCCUACUGCCUUCCU-3′，反向：5′-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3′；GAPDH正向：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3′，反向：5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt表示miR let-7b-3p相對表達量。

1.3 隨訪術后通過電話隨訪或復診等方式隨訪，記錄患者入院治療后90 d內預后情況。采用改良Rankin量表(modified rankin scale,mRS)評分評估患者預后情況：患者無功能受限癥狀為0分；患者有功能受限癥狀，但能完成所有工作及日常生活為1分；輕度殘疾，不能完成以前所有活動，但能獨自處理個人事務記為2分；中度殘疾，需他人協助才能完成日常生活，可獨立行走為3分；中重度殘疾，他人協助下可完成日常生活，但不能獨立行走為4分；重度殘疾，完全失去生活自理能力為5分；死亡為6分。mRS<3分為預后良好，mRS≥3分為預后不良。

1.4 統計學方法采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析。服從正態分布的計量資料用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料用頻數和百分比[n(%)]表示，采用卡方檢驗。用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR let-7b-3p、模型A(出血轉化、ONT、同型半胱氨酸)、模型B(出血轉化、ONT、同型半胱氨酸、miR let-7b-3p)評估急性缺血性腦卒中患者預后的價值。用logistic回歸分析影響急性缺血性腦卒中患者預后的相關因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性缺血性腦卒中患者預后情況355例急性缺血性腦卒中患者出院后3個月內預后不良發生率為45.07%(160/355)。死亡15例(4.23%)，重度殘疾36例(10.14%)，中重度殘疾50例(14.08%)，中度殘疾59例(16.62%)。

2.2 兩組基線資料比較根據患者預后情況將患者分為預后不良組(n=160)和預后良好組(n=195)。兩組在年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、冠心病方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)；在出血轉化、病灶數目、白介素-10、ONT、TOAST病因學分型、同型半胱氨酸、糖化紅蛋白、D-二聚體、let-7b-3p方面比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組基線資料比較

表1續表

2.3 影響急性缺血性腦卒中患者預后的因素將出血轉化(否=0，是=1)、病灶數目(單發=0，多發=1)、白介素-10、ONT、TOAST病因學分型(小動脈粥樣硬化性、心源性栓塞、病因未明確=0，大動脈粥樣硬化性=1)、同型半胱氨酸、糖化紅蛋白、D二聚體、let-7b-3p作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將急性缺血性腦卒中患者預后情況作為因變量納入logistic回歸分析，結果顯示出血轉化、ONT、同型半胱氨酸及let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預后密切相關，見表2。

表2 影響急性缺血性腦卒中患者預后的logistic多因素分析

2.4 miR let-7b-3p、模型A及模型B預測急性缺血性腦卒中患者預后的效能利用logistic回歸分析建立出血轉化、ONT、同型半胱氨酸預測急性缺血性腦卒中患者預后的模型：F=-7.544+0.494×Hcy+0.015×ONT+0.823×出血轉化，將其命名為模型A；出血轉化、ONT、同型半胱氨酸、miR let-7b-3p預測急性缺血性腦卒中患者預后的模型：F=-15.886+0.438×Hcy+0.012×ONT+1.323×出血轉化+18.512×miR let-7b-3p，將其命名為模型B。miR let-7b-3p預測急性缺血性腦卒中患者預后的AUC高于模型A(Z=2.982，P=0.003)，模型B預測急性缺血性腦卒中患者預后的AUC高于miR let-7b-3p及模型A(Z=2.960，P=0.003；Z=6.082，P<0.001)，見表3。

表3 miR let-7b-3p、模型A及模型B預測急性缺血性腦卒中患者預后的效能

圖1 miR let-7b-3p、模型A及模型B預測急性缺血性腦卒中患者預后的ROC曲線

3 討論

急性缺血性腦卒中是臨床常見的腦血管疾病，近年來其發病率逐年升高。急性缺血性腦卒中的最佳治療時間是在發病后4.5 h之內，若未能及時接受治療則會導致患者偏癱或死亡。及早評估急性缺血性腦卒中患者預后情況并采取干預措施對改善患者預后至關重要。此前有臨床研究[8]利用血清學指標如中性粒細胞/淋巴細胞比值等預測急性缺血性腦卒中患者預后情況，但其特異度較低，臨床價值有限，其原因可能與中性粒細胞/淋巴細胞比值易受外界因素如炎癥性疾病的影響，造成其濃度升高，導致特異性降低。miR let-7b-3p作為微RNA家族一員，可在血漿中穩定存在，個體間差異較小。基礎研究[9]證實，miR let-7b-3p可在急性缺血性腦卒中大鼠血漿中表達升高，但未探究其與急性缺血性腦卒中患者預后的關系。因此本研究對其進行探討。

相關研究[10]證實缺血性腦卒中患者let-7b表達低于健康人群，并且let-7b被證實在缺血性腦卒中的病理進展過程中發揮重要作用，因此認為let-7b在與缺血性腦卒中患者的預后可能存在聯系。通過對患者進行隨訪觀察，了解患者預后情況，并比較不同預后患者血漿miR let-7b-3p相對表達量，結果發現預后不良組患者血漿miR let-7b-3p相對表達量高于預后良好組，表明血漿miR let-7b-3p可能與患者預后存在聯系。先前的研究[11]證實let-7b可激活toll-like受體(toll-like receptor，TLR)，而該受體為神經元細胞上TLR7的激活劑，可促進神經元細胞的凋亡，缺血性腦卒中患者預后不良可能與其該途徑存在聯系，但尚需進一步探究。為進一步明確miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預后的關系，本研究采用Logistic回歸分析影響急性缺血性腦卒中患者預后的因素，結果顯示出血轉化、ONT、同型半胱氨酸與急性缺血性腦卒中患者預后密切相關，結果與既往研究[12]相符。此外，本研究結果顯示miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預后密切相關。

熱休克蛋白70的異常表達與急性缺血性腦卒中的發生、發展關系密切[13]。熱休克蛋白70是一種高度保守的應激性蛋白，其基因定位于人1、5、6、9、11及14號染色體上，生理條件下，熱休克蛋白70表達較低，在受到缺血、缺氧刺激后其表達增多，并且熱休克蛋白70的核苷酸替換、缺失或插入突變可調節啟動子的功能或轉錄活性，引起下游基因表達異常，導致急性缺血性腦卒中的發生[14]。此外，側翼區核苷酸的改變則可影響熱休克蛋白70的表達和穩定性，從而調節急性缺血性腦卒中的易感性[15]。動物實驗表明，miR let-7b-3p可調節熱休克蛋白的表達。因此，筆者推測miR let-7b-3p可能通過調節熱休克蛋白70的表達參與急性缺血性腦卒中的疾病進展。

本研究同時構建了miR let-7b-3p、模型A及模型B預測急性缺血性腦卒中患者預后的ROC曲線，結果顯示模型B預測患者預后的效能高于miR let-7b-3p及模型A，表明增加miR let-7b-3p更有利于預測急性缺血性腦卒中患者的預后。

綜上所述，血漿miR let-7b-3p與急性缺血性腦卒中患者預后關系密切，檢測血漿miR let-7b-3p表達情況有助于評估患者預后。本研究存在一定不足，下一將動態檢測血漿miR let-7b-3p表達并進行基礎研究，分析miR let-7b-3p影響急性缺血性腦卒中患者預后的病理生理機制。