Neuroligin-1細胞外域的表達、純化與鑒定

蘇曉男，畢鵬翔，2，黃 青，于欣洋，吳 丹，3，郭艷芹，2

(1.牡丹江醫學院；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院神經內一科；3.牡丹江醫學院醫藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性神經系統退行性疾病，以進行性認知能力下降、人格改變、記憶力衰退為主要臨床特征。2030年，我國AD患者即將達到1500萬，成為世界上AD患病人數最多的國家[1]。因目前AD的治病機理尚不明確，如何防治AD，成為目前亟待解決的世界難題。AD的標志性病理特征包括細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑。突觸丟失在AD患者早期出現，并與認知功能下降有關[2-4]。NL1是一種突觸后粘附蛋白，在突觸的成熟、維持、形成和可塑性中扮演重要角色[5-7]，隨著NL1研究的逐漸深入，人們發現Aβ寡聚體可以直接與NL1細胞外域(1-691aa)相互作用，引發AD。

本研究利用DNA重組技術構建NL1/1-691誘導型原核表達重組質粒，后將重組質粒轉化至大腸桿菌感受態C43中誘導表達，摸索優化誘導表達條件，篩選能夠穩定表達的表達載體。實驗中采用pGEX-6P1質粒，其結構特點是分子量較小，編碼抗氨節青霉素抗性序列、強啟動子tac和編碼谷胱甘肽轉移酶(GST，分子量約為26 kDa)的純化標簽。后續多克隆位點可以插入DNA片段，融合蛋白產物純化方法簡單快速，在細菌中產生的融合蛋白一般以可溶狀態存在，不形成包涵體。另GST蛋白親和純化層析具有載量高、非特異性吸附少，流速快等特點。為提高可溶表達量，本實驗對誘導溫度、誘導時間、誘導濃度及IPTG加入時機進行了優化，通過實驗確定最佳誘導條件，成功表達外源蛋白。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器(1)主要實驗試劑：大腸桿菌感受態細胞C43(上海唯地生物技術公司)；引物由金唯智生物科技有限公司合成；質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)；限制性核酸內切酶XhoI、BamHI(Thermo Scientific公司)；酵母提取物、蛋白胨(英國Oxoid公司)；氯化鈉(Solarbio公司)；GST-tag Purification Resin(BeyoGold公司)。洗脫緩沖液：250 mM Tris Hcl，150 mM HCL，15 mM GSH，pH 8.0。兔抗GST-tag單克隆抗體(Thermo Scientific公司)；蛋白分子量Marker (Bio-rad公司)；ECL化學發光顯色試劑盒(biosharp公司)；(2)主要儀器：SDS-PAGE多功能電泳儀：美國BIO-RAD公司；全自動高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.2 pGEx-6P1-NL1/1-691原核表達載體的構建及純化

1.2.1 pGEx-6P1-NL1/1-691原核表達載體的構建 查找GeneBank數據庫中NL1/1-691基因序列，委托蘇州金唯智生物科技有限公司常規合成目的基因，并針對大腸桿菌的密碼子對表達質粒進行了目的基因序列優化，添加5'BamHI、3'XhoI酶切位點，選擇pGEx-6p1蛋白表達載體，構建質粒pGEX-6p-1-NL1/1-691，使用SnapGene軟件繪制質粒圖譜。取重組質粒1 μL加入50 μL C43感受態中轉化。挑取克隆于1 mL含有氨芐青霉素抗性LB培養基中37 ℃活化16 h，進行菌液PCR驗證，反應體系為2×Taq PCR Mastermix 7.5 μL，ddH2O 6 μL，引物前后各0.5 μL，菌液0.5 μL，1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測，反應條件為：150 V恒壓，25 min左右，凝膠成像分析系統成像。

1.2.2 重組質粒的轉化及陽性克隆的篩選 使用質粒小提試劑盒從菌液中提取質粒，進行質粒及質粒雙酶切驗證，反應體系為pGEX-6p-1-NL1/1-691質粒42 μL，綠色10×Buffer 5μL，BamHI、XhoI各1.5 μL，共50 μL體系37 ℃恒溫培養45 min。1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測，反應條件為：150 V恒壓，25 min左右，凝膠成像分析系統成像。

1.2.3 NL1/1-691誘導表達條件的優化 取重組質粒pGEX-6p-1-NL1/1-691 1 μL加入50 μL C43感受態中轉化，42 ℃熱激90 s，冰上靜置2 min，加入500 μL無抗培養基，37 ℃ 180 rpm水平搖床震蕩70 min，后涂布至含有100 μg/mL氨芐青霉素平板上，37 ℃恒溫培養過夜。第二日，挑單個菌落于含有100 μg/mL氨芐青霉素LB培養基中(100 μg/mL)，37 ℃、180 rpm過夜，按1:200比例轉接到100 μg/mL(A+)LB培養基中，當OD值達到0.6左右時，分別加入0.1、0.3、0.5 mmoL/L IPTG 誘導2 h、3 h、4 h，16 ℃、25 ℃、37 ℃培養過夜，次日收集菌體，沉淀使用10 mL PBS重懸，超聲破碎、4 ℃離心，收集上清液過GST親和純化層析柱，GST標簽純化樹脂用PBS清洗兩次。分別收集破碎后全菌3 μL、離心后上清15 μL、過柱流穿液15 μL、清洗后Beads 15 μL，加15 μL SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，15% SDS-PAGE檢測，篩選最佳誘導表達條件。(1)tNL1誘導表達時機的優化：挑取陽性克隆至5 mL氨芐抗性LB培養基中，37 ℃、180 rpm活化過夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培養基中，37 ℃分別水平搖床震蕩菌2 h、3 h、4 h后降溫至25 ℃，加入0.5 mmoL IPTG誘導過夜16 h，按上述方法處理及檢測。(2)tNL1誘導表達溫度的優化：挑取陽性克隆至5 mL氨芐抗性LB培養基中，37 ℃、180 rpm活化過夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培養基中，37 ℃水平搖床震蕩3 h，分別降溫至16 ℃、25 ℃、37 ℃后加入0.5 mmoL IPTG誘導過夜16 h，按上述方法處理及檢測。(3)tNL1 IPTG誘導濃度的優化：挑取陽性克隆至5 mL氨芐抗性LB培養基中，37 ℃、180 rpm活化過夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培養基中，37 ℃水平搖床震蕩3 h，降溫至25 ℃后分別加入0.1 mmoL IPTG、0.3 mmo IPTG、0.5 mmoL IPTG誘導過夜16 h，按上述方法處理及檢測。

1.2.4 pEGx-6p1-NL1/1-691純化 按照上述純化方法、以最佳誘導條件進行誘導，收集后的菌液4500 rpm、離心15 min，收集菌體，10 mL PBS重懸菌體，加入1 mmoL DTT、2 mmoL PMSF，后超聲破碎，14000 rpm離心40 min收集上清，將上清過GST親和純化層析柱(時間>1 h)，2 mL PBS清洗3次，分別取超聲破碎后全菌、離心后上清、過柱流穿液、GST標簽純化樹脂樣品，將純化后樣品SDS-PAGE。蛋白洗脫：GSH洗脫緩沖液(250 mM Tris Hcl，150 mM HCL，15 mM GSH，pH 8.0)，5 min吹打1次，每次半小時取流穿液共4次(總時長2 h)，得到帶GST標簽的目的蛋白。

1.2.5 Western blot檢測NL1/1-691蛋白 將NL1/1-691蛋白樣品Western blot，條件為80 V恒壓30 min轉為120 V，切相應大小膠體蛋白印跡轉移至PVDF膜上，150 mA恒流90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，加入一抗(1:1000比例稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日使用1×TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入二抗(1:10000比例稀釋)孵育60 min，TBST清洗PVDF膜3次，將膜用ECL發光試劑顯色，超靈敏多功能成像儀成像。

2 結果

2.1 pGEx-6p-1-NL1/1-691質粒構建使用SnapGene軟件繪制質粒圖譜，圖中顯示目的基因片段、GST親和純化標簽、5'BamHI and 3'XhoI酶切位點、載體pGEX-6p-1(氨芐青霉素抗性)，如圖1所示。

圖1 pGEx-6p-1-NL1/1-691質粒中目的片段、載體、酶切位點結構示意圖

2.2 pGEx-6p-1-NL1/1-691重組質粒菌液PCR及雙酶切鑒定NL1/1-691細胞外全長片段2073 bp，優化目的基因并轉化感受態細胞，菌液PCR驗證。圖中第1、2、4道無明顯條帶，為陰性克隆；3、5道有明顯的與目標大小一致條帶，為陽性克隆(圖2)。挑取其中一個陽性克隆培養，提取質粒，使用XholI、BamHI對質粒進行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳驗證結果顯示：DNA片段有相應條帶，原核表達載體構建無誤(圖3)。

圖2 pGEx-6p-1-NL1/1-691蛋白菌液PCR鑒定

圖3 pGEx-6p-1-NL1/1-691質粒、雙酶切鑒定

2.3 NL1/1-691蛋白的誘導表達與純化

2.3.1 NL1/1-691蛋白誘導條件檢測 本實驗室成功構建pGEx-6p1-NL1/1-691原核表達載體，經優化誘導表達條件后，重組蛋白以包涵體形式表達，全菌表達量較高、上清表達微弱。由于包涵體蛋白純化難度較大，變性復性多因素不可控，因此本研究按照可溶性表達提取目的蛋白。另誘導時機、誘導劑濃度的選擇對于蛋白表達有很大影響，菌液培養時間不同，OD 600 nm值不同[8]。摸索純化條件，SDS-PAGE顯示，表達的蛋白主要位于103 kDa左右。37 ℃培養3 h(圖4)后降溫到25 ℃(圖5)、加0.5 mmoL/L IPTG(圖6)誘導時表達量最高，并與目的蛋白大小一致。

圖4 不同誘導時間對NL1/1～691表達的影響

圖5 不同溫度對NL1/1～691蛋白表達的影響

圖6 不同濃度IPTG對NL1/1～691蛋白表達的影響

2.3.2 重組蛋白的純化與洗脫 按照上述摸索條件GST親和層析法純化重組蛋白，使用GSH蛋白洗脫緩沖液洗脫蛋白4次并收集，SDS～PAGE結果分析：經GST純化成功得到NL1/1～691重組蛋白(圖7)。

圖7 重組蛋白的純化、洗脫

2.3.3 重組蛋白Western blot鑒定 由于蛋白表達載體pGEx-6P1可使pGEx-6p-1-NL1/1-691重組蛋白帶GST親和標簽，Western blot鑒定時一抗選擇兔抗GST標簽，二抗選擇羊抗兔。經SDS蛋白凝膠電泳、轉膜后分析結果表明：蛋白可被抗原特異性結合，且大小與目的蛋白一致，在103 KDa左右(圖8)，原核表達載體構建成功。

圖8 重組蛋白抗原性檢測

3 討論

近期研究顯示，AD的早期認知能力下降與突觸丟失有關[3-4]。NL-1最初被關注是因其細胞外結構域與乙酰膽堿酯酶同源[9]，但缺乏一個關鍵殘基，現被證明其也是神經突觸黏附對(Neuroxin-Neuroligin)中重要的一員。在興奮性突觸中，當Aβ釋放到突觸間隙時，會與突觸后膜上的NL-1結合，結合后將引起更多Aβ寡聚體的局部聚集，最終影響突觸后區域，引發AD。雖然Aβ1-42寡聚體治病機理目前在分子水平上尚不十分清楚，但NL1可能為Aβ寡聚體的靶向蛋白。本實驗成功構建并檢測表達了NL1/1-691重組蛋白，下一步將研究NL1/1-691蛋白對Aβ誘導的海馬神經元細胞突觸功能的影響。最初的蛋白純化過程NL1/1-691呈包涵體表達，因包涵體純化較為復雜，變性復性較難掌握，我們在實驗中盡量降低包涵體的生成[10-11]。通過25 ℃誘導后不斷改進IPTG濃度：0.1 mmoL/L、0.3 mmoL/L、0.5 mmoL/L，篩選出最佳IPTG濃度為0.5 mmoL/L。經過對IPTG濃度、時間、溫度等條件的摸索，成功表達并純化出高純度的重組蛋白NL1/1-691。本課題使用GST融合蛋白，釋放出天然結構的NL1/1-691，保留了瓊脂糖極好的親水性及大網架結構，與生物活性大分子有很好的相容性，具有載量高、非特異性吸附少，流速快等特點。本實驗構建NL1/1-691原核表達載體，使用可溶性蛋白純化方法得到重組蛋白，其表達量較低，后續大量純化后可過離子交換柱或凝膠柱來富集目的蛋白，同時去除GST標簽。下一步實驗將重組蛋白應用于細胞功能實驗，為研究阿爾茲海默病治療提供新理論基礎。

4 結論

本實驗成功構建NL1/1-691原核表達載體，NL1/1-691蛋白最佳純化條件為：25 ℃培養2 h加IPTG誘導為最佳誘導時機，IPTG誘導濃度為0.5 mmol/L，最佳誘導時間為12 h。