吉西他濱對NK/T細胞淋巴瘤裸鼠模型的影響

李 冀，于成龍，趙 玉，劉赫迪，于建渤

(1.黑龍江省腫瘤疾病防治重點實驗室；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院病理診斷中心，黑龍江 牡丹江 157011)

光學分子影像學技術能夠實時監測腫瘤模型中腫塊的生長、侵襲及轉移情況，同時對抗腫瘤藥物療效做出評定[1-3]。活體成像技術是對發生在活體內的各種生物現象進行無創性可視化的分析方法。近年來，具有分子水平成像能力的圖像診斷技術在醫學領域得到了長足的發展[4]。本研究擬構建NK/T細胞淋巴瘤裸鼠模型，旨在探討生物發光物質在NK/T細胞淋巴瘤裸鼠模型中的變化，并探索吉西他濱用藥后光學分子影像學技術在淋巴瘤診療的新應用。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性BALB/C裸鼠10只，4～5周齡，體重8～10 g，北京維通利華實驗動物中心提供。飼養在SPF級超凈層流室，恒溫(24～26 ℃)飼養，墊料、籠具、飼料及飲水均經過高壓滅菌和紫外線照射處理。

1.1.2 材料 細胞株 NK92-Luc購自美國 ATCC 公司；RPMI-1640 培養液和胎牛血清購于美國Gibco 生物公司；人白細胞介素-2 (IL-2) 購于 R&D公司；螢火蟲熒光素酶D-Luciferin 購自美國Selleck生物科技公司；異氟烷購自湖北鴻運隆生物公司。

1.1.3 儀器設備 小動物活體成像儀Berthold Technology-NightOwl LB983；倒置熒光顯微鏡為尼康 TS100-F。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 NK92-Luc細胞培養在含10% FBS、1% PBS、89% RPMI-1640、100 U IL-2及1.5 μg/mL嘌呤霉素培養基中，培養瓶放入37 ℃、5%CO2恒溫培養箱。根據細胞生長情況，更換培養液，取對數期細胞進行實驗。

1.2.2 NK92-Luc細胞體外生物發光活性檢測 取對數生長期的NK92-Luc細胞懸浮于4 mL RPMI 1640培養液中，100 μL/孔接種于96孔板中，調整細胞數量分別為每孔100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600個，每孔設置兩個復孔，共3組；其中兩組每孔加入1 μL熒光素酶底物 (15 mg/mL)；另一組不加熒光素酶底物作為陰性對照。靜置5 min，小動物活體成像儀Berthold Technology-NightOwl LB983檢測NK92-Luc細胞體外發光情況，分析發光強度和細胞數之間的關系。

1.3 NK92-Luc裸鼠皮下腫瘤模型的構建及鑒定

1.3.1 構建NK92-Luc淋巴瘤裸鼠皮下腫瘤模型 取對數生長期NK92-Luc細胞懸液，移入15 mL離心管，離心 (1000 r/min，5 min)，棄上清；PBS洗滌兩次，適量PBS重懸，細胞計數板計數，按照1×107個細胞/只接種密度，配置細胞懸液；將裸鼠固定在超凈工作臺中，75%乙醇消毒裸鼠左側季肋皮膚，按每只100 μL腫瘤細胞懸液(含1×107個細胞)接種于裸鼠左側季肋皮下，觀察裸鼠飲食水、活動正常，2～3 d后于左季肋部觀察到米粒大小隆起，此為建模成功。

1.3.2 小動物活體成像 將NK92-Luc裸鼠腫瘤模型隨機分為對照組(PBS組)，實驗組(吉西他濱組)。對照組：每隔兩天皮下注射100 μL/只PBS；實驗組：每隔兩天皮下注射100 μL/只吉西他濱(含吉西他濱50 μg)。首次給藥前及給藥后第5天、第8天、第11天用小動物活體成像儀Berthold Technology-NightOwl LB983成像分析。方法：腹腔注射50 μL熒光素酶底物(1 mg/mL)，記錄注射熒光素酶底物時間；注射熒光素酶第7 min時將裸鼠放入麻醉箱中進行異氟烷吸入性麻醉，注射熒光素酶第9 min時將實驗組放入活體成像儀暗箱平臺成像；采用儀器配備的indigo軟件對圖像和數據進行分析處理，統計分析腫瘤治療后發光強度(參數：曝光時間5 min/次)。

1.3.3 腫瘤體積測量 使用游標卡尺于給藥前及給藥后第5天、第8天、第11天測量兩組裸鼠腫瘤最長徑和最短徑，計算腫瘤體積(體積=1/2長徑×短徑2)；繪制裸鼠腫瘤動態生長曲線。

1.3.4 HE染色鑒定腫瘤 處死小鼠，取腫塊部位，放入10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.4 統計學分析應用 SPSS 23.0統計軟件，計量資料以“均數±標準差”表示，行t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NK92-Luc培養和形態學觀察結果在顯微鏡下，NK92-Luc細胞在培養基中懸浮生長，成簇生長，細胞呈圓形、類圓形(見圖1)。

圖1 NK92-Luc細胞形態(A：×40；B：×200)

2.2 NK92-Luc細胞體外生物發光活性檢測用熒光素酶檢測NK92-Luc細胞發光活性(圖2)，生物發光活性與細胞數呈正比(圖3)。

圖2 NK92-Luc細胞發光活性)

圖3 生物發光強度與NK92-Luc細胞數量關系

2.3 吉西他濱對裸鼠腫瘤生長的影響

2.3.1 兩組活體成像結果 注射后第3天肉眼未見明顯腫塊，但是生物發光成像已經可以檢測到皮下腫瘤細胞的生物發光信號：隨著時間延長，生物發光信號顯示腫瘤的體積逐漸增大；實驗組腫瘤體積小于對照組體積，見圖4。

圖4 兩組裸鼠腫瘤生長情況的活體成像圖

2.3.2 兩組腫瘤體積結果 隨著時間延長，兩組裸鼠腫瘤體積逐漸增大。給藥后5 d、8 d、11 d對照組腫瘤體積大于實驗組，差異具有顯著性(P<0.05)，見表1。

表1 兩組腫瘤體積變化(cm3)

2.4 HE染色結果肉眼所見，瘤體為圓形或類圓形腫塊，腫瘤外周有纖維組織包繞，切面灰紅灰白、魚肉狀，質嫩較脆，易出血。HE染色見明顯的淋巴樣細胞增生，呈彌漫性生長、常累及血管，見圖5。

圖5 裸鼠皮下腫瘤HE染色結果(A:×100, B:×400)

3 討論

淋巴瘤是淋巴細胞及其前體細胞克隆性增生而形成的一類腫瘤，也是機體免疫系統的免疫細胞發生的一類腫瘤，可原發于淋巴結和結外淋巴組織。其來源于血液淋巴系統的惡性腫瘤,是世界范圍內十大惡性腫瘤之一。亞洲人群多見，外周T細胞淋巴瘤為我國發病最常見類型，約占1/3。最常累及上呼吸道附近，其它包括皮膚、腸道等。成人為主，男性較女性多見[5]。隨著社會發展，淋巴瘤發病年齡呈明顯年輕化趨勢，發病率逐年上升，5年生存率不足50%[6]。

活體生物發光成像技術是一種新型影像檢測技術。生物發光現象依賴于酶與底物相互作用產生的一種化學變化，采用熒光素酶，底物隨熒光素酶(例如D-熒光素酶)的類型而變化[7]。此技術，為研究腫瘤生物學和治療提供了一種科學方法[8]。近年來，活體生物發光成像技術在生命科學中的多種領域被廣泛應用，現已成為研究實驗動物通用工具之一[9]。此技術能夠無創、連續、時時監測腫瘤的變化，為相關動物實驗的研究提供科學依據[10]。

吉西他濱(Gemcitabine)是一種胞嘧啶核苷類似物，現已被廣泛應用于臨床治療，臨成為床一線化療藥物之一對多種癌癥具有明顯的抗腫瘤作用。本研究選擇NK92-Luc 細胞，采用左側季肋皮下接種的方式構建裸鼠皮下腫瘤，4 d后于左季肋部觀察到米粒大小隆起，成功建立腫瘤模型；采用測量體積的方式觀察腫瘤的生長情況；在給藥后第5、8、11天通過小動物活體成像儀觀察腫瘤生物發光成像情況。發現隨著吉西他濱治療時間增加，實驗組裸鼠腫瘤體積明顯小于對照組。說明吉西他濱對腫瘤的生長起到了抑制作用。本實驗也證明利用生物發光成像技術，對進一步研究腫瘤的發生發展提供了簡單方便可行的方法。綜上所述，本研究以NK92-Luc 細胞、裸鼠皮下腫瘤模型為研究對象，成功構建裸鼠皮下腫瘤模型，通過活體成像技術，動態觀測腫瘤的發展變化，初步探索 NK/T 細胞淋巴瘤診斷新方法，具有重要的科學價值和臨床意義。