miRNA-21對2型糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的影響

白雨鑫，孫立新，劉 勇，李欣欣，吳 琦，郭素芬，潘艷明，成永霞

(牡丹江醫學院基礎醫學院病理學與病理生理學教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)是發生于糖尿病患者但不能用冠心病等器質性病因解釋的一種心肌病變[1]，主要表現為心肌結構紊亂，心功能障礙甚至出現心力衰竭。近年來對DCM的發病機制有較為深入的研究，通過查閱文獻得知miRNA-21對于心血管系統疾病會產生一定的影響，并發現抑制miRNA-21 表達對心肌損傷具有一定的保護作用[2]。同時，心肌纖維化做為糖尿病性心肌病的主要病理表現[3]，愈來愈引發關注，因此，本實驗將立足于觀察miRNA-21對糖尿病心肌纖維化的影響，對糖尿病性心肌病的發病機制進行深入探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取6周齡SPF級SD大鼠，共32只，體重(180±20)g，購自遼寧長生生物有限公司，動物飼養于牡丹江醫學院醫藥研究中心SPF級動物房，自由攝取飼料和水，12 h晝夜交替照明。本實驗已經通過牡丹江醫學院動物倫理委員會審查并獲得批準。

1.1.2 實驗試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司(美國)；高脂高糖飼料(酪蛋白、玉米淀粉、玉米糊精、糖、纖維素、豆油等)；由小黍有泰(北京)生物科技有限公司加工制備；SPF級大鼠維持飼料由遼寧長生生物技術股份有限公司加工制備；逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒購自銳博生物科技有限公司；改良Masson三色染色液購自北京索萊寶科技有限公司；α-SMA單克隆抗體購自碧云天生物技術公司；miRNA-21慢病毒購自沈陽萬類生物科技有限公司；血糖測試儀和血糖試紙購于上海羅氏公司；包埋機、切片機來自Leica 公司(德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 32只SD大鼠自由攝取食物和水，適應性喂養1周。對大鼠進行隨機分組，分為對照組，DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組，每組8只。對照組大鼠普通維持飼料喂養，而DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組分別進行高糖高脂飼料喂養。喂養4周后，給予DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組單次腹腔注射溶解于檸檬酸鈉緩沖液的鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，其中有4只大鼠注射2次，而對照組大鼠注射等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。72 h后對各組大鼠進行空腹血糖測量，空腹血糖≥11.1 mmol/L 提示2型糖尿病建模成功。第8周進行慢病毒轉染，DCM+干擾miRNA-21組大鼠經尾靜脈注射1×108TU/mL干擾miRNA-21慢病毒，而DCM+干擾對照組經尾靜脈注射1×108TU/mL的對照慢病毒，每只大鼠單次注射200 L(轉染周期4周)。第12周所有試驗用鼠處死取材。

1.2.2 血糖和體重的測量 注射STZ 72 h后，各組大鼠禁食不禁水12 h后經尾靜脈采血利用血糖儀進行測量，之后每2周對各組大鼠進行體重和空腹血糖測量并記錄。

1.2.3 qRT-PCR 取50 mg大鼠心肌組織加入TRIzol裂解液，以氯仿-異丙醇體系提取樣品總RNA，經微量核酸儀檢測其純度和濃度，根據miR-21逆轉錄試劑盒說明書進行操作，合成cDNA模板，混入SYBR Green qPCR Mix 進行qRT-PCR檢測。miR-21的上游引物5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物5'-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′；內參基因 U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，內參基因 U6 下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。參數設置：95 ℃，10 min循環1次，95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃10 s，共40個循環，采用2-△△CT法進行計算。

1.2.4 HE染色 心肌組織放置在4%多聚甲醛固定72 h，石蠟包埋，切片5 μm。脫蠟，常規逆梯度乙醇脫水，蘇木素-伊紅染色，再次順梯度乙醇浸泡，中性樹膠封固,顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 Masson染色 心肌組織常規脫水，包埋切片5 μm，烘片4 h，常規乙醇脫水并清洗，根據 Masson試劑盒說明依次加入各溶液，最后中性樹膠封固,顯微鏡下觀察并選取不同視野拍照。利用Image J圖像分析系統計算膠原纖維面積百分率=膠原面積/總面積。

1.2.6 免疫組織化學 心肌組織包埋，切片5 μm并脫蠟，常規乙醇脫水并清洗，進行抗原修復，封閉液封閉后，進行一抗孵育過夜，滴加二抗，清洗后蘇木素染色，封片并顯微鏡下觀察；通過Image J圖像分析系統進行分析；陽性面積百分率=褐色顆粒面積/總面積。

1.3 統計學方法實驗數據采用SPSS 25.0軟件進行分析，計量資料采用“均數±標準差”表示，多個組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況對照組大鼠飲水量和進食量正常，排便排尿量正常，毛發順有光澤，精神狀態較好。模型組大鼠進食量多，飲水量增加，后期尿量逐漸增加且尿中帶有強烈的酮味，毛發豎起呈暗黃色，狀態較差。與對照組相比，DCM組、DCM+干擾miRNA-21組、DCM+干擾對照組大鼠在高脂飲食4周時出現了明顯的腹型肥胖(圖1)。

圖1 對照組與模型組大鼠腹部外觀

對照組大鼠體重隨著時間變化穩定增長，DCM組大鼠體重前期增長較快，隨著病情的進展體重有所降低(P<0.05)，差異具有統計學意義。與DCM組相比，DCM+干擾對照組的體重差異不明顯(P>0.05)，差異無統計學意義。而與DCM+干擾對照組相比，DCM+干擾miRNA-21組的大鼠體重在轉染后體重有所上升(P<0.05)，差異有統計學意義(表1)。

表1 各組大鼠體重變化情況

2.2 各組大鼠血糖監測結果對照組大鼠空腹血糖維持穩定且均在正常血糖范圍(3.9～6.1 mmol/L)，DCM組大鼠與對照組相比，空腹血糖≥11.1 mmol/L，且空腹血糖維持在較高的水平，P<0.05有統計學意義。與DCM組相比，DCM+干擾對照組無明顯差異(P>0.05)，而與DCM+干擾對照組相比，DCM+干擾miRNA-21組空腹血糖水平在轉染后有所下降，P<0.05有統計學意義(表2)。

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較

2.3 各組大鼠qRT-PCR結果與對照組相比，DCM組和DCM+干擾對照組心肌組織中miRNA-21的表達量增加(P<0.001)，而DCM+干擾對照組相比，DCM+干擾miRNA-21組表達有所下降(P<0.001)，以上結果說明DCM組大鼠心肌組織中miRNA-21的表達升高，并且說明DCM+干擾miRNA-21組轉染成功(表3)。

表3 各組大鼠心肌miR-21表達情況比較

2.4 各組大鼠HE染色結果對照組大鼠中，8只大鼠均表現心肌細胞纖維排列整齊，胞質胞核染色均勻，結構完整清晰；而在DCM組大鼠中，有6只大鼠的心肌細胞出現排列不整齊，細胞質深染，局部心肌纖維出現斷裂，心肌細胞間有炎細胞浸潤，其余兩2只表現不明顯。在DCM+干擾對照組中8只大鼠均出現了心肌纖維斷裂等表現，但與DCM組大鼠無明顯差別，而在DCM+干擾miRNA-21組大鼠中，有7只大鼠心肌細胞損傷程度有所改善，間質的炎性細胞也有所減少(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織的HE染色結果(×200)

2.5 各組大鼠Masson染色結果在Masson染色中心肌纖維表現為紅色而膠原纖維表現為藍色；對照組大鼠的心肌組織中均表現為僅有少量的藍色膠原纖維且分布均勻，而8只DCM組大鼠的心肌組織中，膠原纖維表達量均明顯升高，且主要表現血管周圍并向有所蔓延(P<0.05)。與對照組相比，有7只DCM+干擾對照組大鼠心肌組織中膠原纖維表達量升高(P<0.05)，但與DCM組相比無統計學差異。與DCM+干擾對照組比較，有7只干擾miRNA-21表達的大鼠心肌膠原纖維沉積有所改善，膠原纖維表達量下降(P<0.05)(圖3、表4)。

圖3 各組大鼠心肌組織的Masson染色結果(×200)

表4 各組大鼠心肌組織膠原纖維表達量

2.6 各組大鼠免疫組化結果在正常組大鼠心肌組織中，α-SMA表達量較低，而與對照組相比，在DCM組大鼠心肌組織中，α-SMA表達水平顯著升高(P<0.05)，主要集中表現在心肌間質和少量血管周圍，DCM+干擾miRNA-21組心肌組織中α-SMA表達量相比DCM+干擾對照組降低(P<0.05)。說明2型糖尿病心肌病大鼠會出現α-SMA的沉積，進一步降低miRNA-21的表達會減少α-SMA的產生(圖4、表5)。

圖4 免疫組化染色檢測心肌組織中α-SMA的表達情況(×400)

表5 各組大鼠心肌組織α-SMA蛋白定量分析

3 討論

糖尿病是一種代謝性疾病，臨床表現為持續性高血糖、體重減輕、多飲等，隨著病情的加重會表現為微血管并發癥，包括腎臟、視網膜、肝臟、心臟等器官損傷[4]。近年來研究發現糖尿病微血管并發癥進展迅速并引發一系列不可逆性的損傷，合并心血管系統并發癥的糖尿病患者致死率增加2倍以上[5]。DCM發病不依賴于高血壓、冠狀動脈疾病和其他已知心臟疾病，主要表現為心肌細胞肥大、心肌間質膠原沉積和心肌纖維化，其中心肌纖維化可致心肌僵硬度增加、心室舒張功能減退、冠狀動脈儲備下降，甚至引發猝死[6-7]。鑒于以上嚴重后果，糖尿病性心肌纖維化已引起國內外學者廣泛重視，對心肌纖維化治療方法的研究也日益深入。

研究發現miRNA-21參與心臟、腎臟、肝臟等多個器官纖維化的發生發展[8-10]，Liu等[11]發現糖尿病小鼠的腎小球系膜細胞中miRNA-21表達升高，引起膠原纖維大量堆積，最終進展為腎間質纖維化。Yuan[12]等發現miR-21通過靶向Smad 7促進心肌梗死后的心肌纖維化。miRNA-21是否影響糖尿病大鼠心肌纖維化的發生發展目前尚不明確。本實驗通過喂養高糖高脂飼料之后進行腹腔注射STZ從而建立2型糖尿病模型，結果發現與對照組大鼠相比，DCM組大鼠前期體重增長之后出現體重下降趨勢并且空腹血糖升高；與DCM組相比，DCM+干擾miRNA-21組大鼠在轉染后體重有所增加，空腹血糖水平下降，說明抑制miRNA-21對2型糖尿病大鼠的體重和空腹血糖有一定的影響。通過心肌組織病理學染色進一步觀察糖尿病心肌纖維化，觀察得到DCM大鼠心肌結構排列紊亂，心肌細胞變性壞死，出現心肌細胞間質膠原纖維堆積；而降低miRNA-21的表達后減輕心肌細胞的損傷以及膠原纖維的產生，從而改善糖尿病心肌纖維化。在免疫組化中觀察到降低miRNA-21的表達可以減少心肌間質中α-SMA的合成及沉積，進而抑制DCM的進一步發展。

綜上所述，抑制miRNA-21表達可以減輕心肌細胞損傷，從而延緩DCM心肌纖維化的進展，以上結果為DCM的機制探討及其纖維化的臨床治療提供了新的思路和方向。