LY294002聯合順鉑對卵巢癌細胞A2780和SKOV3增殖、侵襲的影響及機制

范競文，方 超，李婉玉，任春慧，馮 晨，馮 華

(1.牡丹江醫學院；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性生殖系統中致死率最高的惡性腫瘤[1]。發病早期隱匿，缺乏典型的臨床癥狀和有效的篩查與診斷方法，約70%患者初診時已處于晚期[2]。順鉑作為卵巢癌臨床治療的一線用藥，在卵巢癌的化療中發揮了重要的作用，大多數卵巢癌患者起初對順鉑敏感，但是最終常發展為耐藥[3-4]。因此尋找有效的的途徑增強卵巢癌對順鉑的敏感性，抑制其耐藥并探討其分子機制，成為研究的熱點。PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)信號轉導通路被認為是腫瘤細胞存活和介導其耐藥的關鍵通路，相關研究表明LY294002(PI3K泛抑制劑)可以增強某些抗腫瘤藥物的療效，減少化療抵抗作用[5-7]。但目前對LY294002聯合順鉑對卵巢癌增殖和侵襲影響的具體機制研究甚少。因此本研究旨在觀察LY294002聯合順鉑對卵巢癌細胞增殖、侵襲的影響，并以PI3K/AKT通路為靶點，探討其作用機制，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人卵巢癌細胞系A2780和SKOV3由哈爾濱醫科大學病理教研室饋贈。

1.1.2 主要試劑 LY294002購自MCE公司；RPMI1640培養基、胎牛血清購自Biosharp公司；順鉑、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒購自meilunbio公司；β-actin、MMP2、MMP9、AKT抗體購自proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A2780和SKOV3細胞常規培養于5% CO2、37 ℃培養箱中，用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RPMI-1640的培養基培養，2～3 d換液，待細胞融合度達80%～90%時用0.25%胰酶進行消化、傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8測定細胞增殖抑制率 取對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化后離心，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基稀釋成單細胞懸液，接種到96孔板中，調整細胞濃度至8000個/孔，每孔加入RPMI1640培養液100 μL，并設置空白對照。培養24 h后棄去原培養液，每孔加入不同濃度的LY294002(10、20、40、60 μmol/L)和順鉑(5、15、25、40 μmol/L)100 μL含藥培養液，每個濃度設5個復孔；無細胞孔加入不含藥物的培養液。繼續培養24 h后棄去原培養液，每孔加入含10 μL CCK-8溶液的RPMI1640培養基100 μL，繼續培養2 h后，用酶標儀檢測450 nm下各孔的OD值。計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=1-(OD實驗組-OD空白對照組)/(OD正常對照組-OD空白對照組)×100%。用Graphpad prism 8.0計算IC50(半數抑制濃度)值并繪制細胞增殖抑制曲線。

1.2.3 細胞劃痕實驗測定遷移能力 取對數生長期的A2780和SKOV3細胞，將細胞接種到6孔板中，每孔含有6×105個細胞，培養24 h后每孔垂直于6孔板劃3條平行線，然后用PBS洗去脫落細胞，加入無血清培養液，根據CCK-8所測兩種細胞對于兩種藥物的IC50值確定加藥濃度后分組，分為正常對照組、LY294002組(20 μmol/L)、順鉑組(10 μmol/L)、LY294002+順鉑組(20 μmol/L+10 μmol/L)。最后將所有細胞放入含5% CO2，37 ℃的培養箱中，分別記錄干預24 h、48 h后的細胞劃痕愈合情況，用Image J軟件進行相關分析。

1.2.4 Western Blot 收集各組細胞樣本，加入RIPA液裂解，于4 ℃、12000 r/min條件下離心15 min，取上清液為細胞蛋白檢測樣本，BCA法測定總蛋白含量。配制10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，蛋白上樣跑電泳，分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋后的一抗(β-catin 1:2000、MMP2 1:800、MMP9 1:800、AKT 1:1000)4 ℃冰箱孵育過夜，用TBST液漂洗3次，每次5 min；加入二抗室溫撫育1 h，再用TBST液漂洗3次，每次5 min，ECL顯影。每個樣本重復3次。應用Image J軟件分析條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析并用Graphpad prism 8.0作圖。符合正態分布的計量資料以“均數±標準差”表示，多組間數據的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LY294002和順鉑對卵巢癌A2780、SKOV3細胞增殖的影響結果表明，LY294002和順鉑對細胞增殖的抑制作用隨著藥物濃度升高而增加，并且呈劑量依賴性，當LY294002濃度在30 μmol/L時對兩種細胞均有明顯的抑制作用，而后隨藥物濃度的增加對A2780細胞的抑制作用要強于SKOV3細胞。當順鉑濃度在15 μmol/L時對兩種細胞均有明顯的抑制作用，超過20 μmol/L時，對A2780細胞的抑制率明顯高于SKOV3細胞。LY294002和順鉑對A2780、SKOV3細胞的增殖抑制率見圖1。

圖1 不同濃度的LY294002和順鉑對A2780和SKOV3細胞增殖的抑制作用

2.2 LY294002和順鉑對A2780、SKOV3細胞遷移的影響結果表明，劃痕24 h后，與對照組相比，A2780和SKOV3細胞的LY294002組、順鉑組及LY294002+順鉑組遷移面積顯著減小(P<0.01)，與LY294002組或順鉑組相比，LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細胞遷移距離均顯著減小，差異有統計學意義(P<0.01)；劃痕48 h后，劃痕面積明顯縮小，差異有統計學意義(P<0.01)，效果比24 h更明顯。各組A2780、SKOV3細胞遷移面積見圖2、圖3。

圖2 各組A2780細胞劃痕實驗結果(×10)

圖3 各組SKOV3細胞劃痕實驗結果(×10)

2.3 LY294002聯合順鉑對A2780、SKOV3細胞MMP2、MMP9蛋白表達的影響結果表明，與對照組相比，LY294002組、順鉑組及LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細胞MMP2、MMP9的蛋白表達水平均較正常對照組降低(P<0.05)；同時，與LY294002組或順鉑組單獨用藥相比，LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細胞MMP2、MMP9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。各組A2780、SKOV3細胞MMP2、MMP9蛋白表達水平見圖4、圖5。

2.4 LY294002聯合順鉑對A2780、SKOV3細胞AKT蛋白表達水平的影響結果表明，與對照組相比，LY294002組、順鉑組及LY294002聯合順鉑組A2780、SKOV3細胞AKT水平均顯著降低(P<0.05)，同時，與LY294002組或順鉑組相比，LY294002+順鉑組A2780、SKOV3細胞AKT水平顯著降低(P<0.05)，各組A2780、SKOV3細胞AKT蛋白表達水平見圖4、圖5。

圖4 各A2780細胞MMP2、MMP9及AKT的蛋白表達水平

圖5 各組SKOV3細胞MMP2、MMP9及AKT的蛋白表達水平

3 討論

卵巢癌為女性生殖系統第一致死率的惡性腫瘤，發病率居婦科惡性腫瘤的第3位，僅次于子宮內膜癌和子宮頸癌，由于缺乏有效的早期篩查及診斷方法，超過70%的卵巢癌患者一經診斷已處于晚期[8]。雖然很多晚期患者最初受益于滿意的腫瘤細胞減滅術聯合以鉑類為基礎的化療，但近90%的患者仍會復發，并最終導致死亡[9-10]。雖然最初鉑類(順鉑/卡鉑) 聯合紫杉醇化療對大約80%的患者有效，但卵巢癌的治療難點在于其侵襲性強以及易產生耐藥性，后期易復發，迫使患者進行全部化療療程，不但治療效果欠佳，同時會出現嚴重的不良反應。在這種情況下急需一種新的聯合治療策略來提高晚期卵巢癌的臨床療效。與此同時，闡明卵巢癌的遷移、侵襲及轉移機制，對于臨床上尋找敏感的診斷指標及基因治療靶點，從而提高卵巢癌患者的生存期無疑具有極其重要的意義[11]。

PI3K/AKT/mTOR信號通路作為細胞內重要信號轉導通路之一，參與很多重要的生物學過程的調控，有報道指出PI3K/AKT/mTOR信號通路在卵巢癌中的增殖、侵襲、細胞周期進程、血管形成及耐藥中發揮著重要的作用，因而PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑成為卵巢癌治療新方向。因此本研究選用PI3K抑制劑LY294002聯合順鉑作用于卵巢癌細胞，探討其聯合應用能否增強順鉑的化療效果，抑制腫瘤的增殖、侵襲和遷移。

本研究從不同濃度藥物LY294002和順鉑作用人卵巢癌A2780和SKOV3細胞，觀察對增殖抑制效果，結果發現，LY294002和順鉑均對細胞增殖有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度升高而增加呈劑量依賴性。惡性腫瘤難治的原因之一就是腫瘤細胞的遷移侵襲造成體內轉移，為腫瘤治療造成很大阻礙，本研究在明確LY294002和順鉑抑制增殖效果的基礎上，通過劃痕實驗驗發現劃痕24 h后，LY294002聯合順鉑遷移面積顯著減小，劃痕48 h后，劃痕面積明顯縮小，效果比24 h更明顯。與單獨用藥相比，LY294002聯合順鉑可降低A2780、SKOV3細胞MMP2、MMP9蛋白表達水平。表明LY294002可促進順鉑抑制A2780和SKOV3 細胞的遷移和侵襲。AKT是PI3K/AKT信號通路中主要的下游效應靶基因，對細胞生存、細胞周期進程，細胞生長，新陳代謝有很大的影響。因此，抑制PI3K/AKT通路可以阻止腫瘤細胞的生長或發展。本研究發現，與LY294002組或順鉑組相比，LY294002聯合順鉑可顯著降低A2780和SKOV3細胞AKT水平，說明順鉑抑制A2780和SKOV3細胞增殖、侵襲作用與調控PI3K/AKT通路有關。

本研究尚存在一定的局限性，目前僅在細胞水平證實了順鉑和LY294002對卵巢癌的作用，但尚未在動物模型中深入研究其作用和相關機制，且具體治療效果還有待于臨床評估。我們可以在未來不斷優化靶向藥物的聯合治療，使不同作用機制的藥物配合使用，在最大程度上發揮協同抗腫瘤作用，實現多選擇性的個體化分子靶向治療[12]。

綜上所述，LY294002和順鉑能協同抑制人卵巢癌細胞株A2780和SKOV3的增殖和侵襲，順鉑聯合LY294002協同抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路來實現。本研究為卵巢癌治療方式的選擇提供新的理論依據。但其更多潛在的抗腫瘤機制有待進一步深入研究。