TUSC3基因表達對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響

劉佳奇，楊 爽,宋 潔，卜曉波

(牡丹江醫(yī)學(xué)院生物教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

TUSC3(tumor suppressor candidate gene 3)，在過去數(shù)年中曾被命名為M33、N33等。該基因位于8號染色體短臂2區(qū)2帶(8p22)，8號染色體全長146.364 Mb，包含1198個基因，是一個比較典型的高重復(fù)含量和高節(jié)段重復(fù)程度的染色體[1-2]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)TUSC3在乳腺癌組織和乳腺癌旁組織中存在差異表達，并對乳腺癌細胞的增殖能力產(chǎn)生了影響，分析實驗結(jié)果提示該基因在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌作用[3]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過劃痕實驗和Transwell實驗分別檢測了TUSC3表達水平不同時的乳腺癌細胞的運動能力和侵襲能力。通過Western blot 實驗檢測TUSC3表達水平不同的乳腺癌細胞中E-cadherin、Vimentin的表達，分析結(jié)果的相關(guān)性，為下一步實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織材料乳腺癌細胞株MDA-MB-231(來自牡丹江醫(yī)學(xué)院病理教研室)；正常乳腺組織蛋白MCF-10A及乳腺癌細胞株MCF-7(來自哈爾濱醫(yī)科大學(xué))。

1.2 主要試劑TUSC3兔抗人單克隆抗體(寶泰克生物科技有限公司，產(chǎn)品編號ABIN3185751)、TUSC3過表達質(zhì)粒(蘇州吉瑪基因股份有限公司)、TUSC3 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)、Lipo200轉(zhuǎn)染試劑(廣州銳博生物科技有限公司)，Tranwsell試劑盒(寶泰克生物科技有限公司)，Vimentin 、E-cadherin抗體(中國中杉金橋)。

1.3 操作方法

1.3.1 轉(zhuǎn)染細胞系建立 將處于對數(shù)生長期的乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7分別接種在6孔板中。分別通過TUSC3 si-RNA建立TUSC3低表達細胞系(MDA-MB-231)及對照組(TUSC3-siRNA；Scrambled-siRNA)，通過TUSC3過表達質(zhì)粒建立TUSC3過表達細胞系(MCF-7)及對照組(pcDNA3.1-TUSC3；pcDNA3.1-NC)，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3.2 劃痕實驗 用200 μL移液管尖端輕輕刮擦細胞，然后PBS洗滌。使用光學(xué)顯微鏡在0 h、48 h分別獲得圖像，并記錄劃痕面積(S1、S2)，細胞遷移率(%)=(S1-S2)/S1×100%，每組實驗重復(fù)3次。

1.3.3 Transwell實驗 將配置好的Matrigel膠加入Transwell小室裝置的上室底部，凝固后，將重懸好的細胞以1×104濃度接種于上室中，在上室和下室分別加入200 μL無血清DMEM和600 μL含有10%胎牛血清的DMEM，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)14～16 h。將下面侵入的細胞使用甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。使用光學(xué)顯微鏡取三個不同視野拍照，計數(shù)穿至膜下層的細胞數(shù)，取平均值，每組實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用“均數(shù)±標準差”表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUSC3高/低表達對乳腺癌細胞遷移能力的影響轉(zhuǎn)染后，乳腺癌細胞的運動能力因TUSC3的表達不同而發(fā)生變化，見圖1。與對照組比較，敲除MDA-MB-231細胞中TUSC3后的細胞遷移率增高(P<0.0001)，與對照組比較，使MCF-7細胞中TUSC3過表達后，細胞遷移率下降(P<0.0001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 劃痕實驗檢測處理后細胞遷移能力

2.2 TUSC3高/低表達對乳腺癌細胞侵襲能力的影響與對照組比較，在MDA-MB-231細胞中，敲減TUSC3表達后，穿膜細胞計數(shù)明顯高于對照組，提示細胞侵襲能力上升(P=0.0055)；與對照組比較，在MCF-7細胞中，過表達TUSC3后，穿膜細胞計數(shù)明顯低于對照組，提示細胞侵襲能力下降(P=0.0023)，見圖2。

圖2 侵襲實驗檢測處理后細胞侵襲能力

2.3 敲減TUSC3表達促進乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲與EMT相關(guān)通過Western blot實驗檢測乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7在分別敲減、過表達后，E-cadherin和vimentin的表達。結(jié)果提示，在MDA-MB-231細胞中，與對照組相比，當敲減TUSC3表達時，E-鈣粘蛋白表達下降(P<0.05)，波形蛋白上升(P<0.05)，提示與EMT相關(guān)。在MCF-7細胞中，與對照組相比，當TUSC3在細胞中過表達時，E-鈣粘蛋白表達下降(P>0.05),未見統(tǒng)計學(xué)意義，波形蛋白下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 Western blot檢測處理后細胞中E-cadherin、Vimentin表達

3 討論

TUSC3以8號染色體短臂2區(qū)2帶的短臂缺失，基因異常甲基化等形式在許多癌癥(前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、大腸癌[6])的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮不同作用。在之前的研究中我們通過免疫組化和Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)TUSC3在乳腺癌組織中表達低于乳腺癌旁組織。我們選擇了兩個乳腺癌細胞系(MDA-MB-231、MCF-7)根據(jù)該細胞系中TUSC3的表達情況，通過使用siRNA和過表達質(zhì)粒分別建立了TUSC3高/低表達的乳腺癌細胞系，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾TUSC3的表達后，乳腺癌細胞的增殖能力產(chǎn)生了變化[3]。

乳腺癌高死亡率的主要原因是其發(fā)生了遷移和侵襲。因此，我們通過劃痕實驗、Transwell遷移實驗、Transwell侵襲實驗觀察干擾TUSC3表達后細胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，過表達TUSC3后，乳腺癌細胞的劃痕閉合率與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照組相比更低，穿膜細胞數(shù)也更少，提示遷移能力和侵襲能力受到了抑制。敲減TUSC3的表達后，乳腺癌細胞的劃痕閉合率與小干擾RNA轉(zhuǎn)染的對照組相比更高，穿膜細胞數(shù)也更多，提示乳腺癌細胞的遷移能力和侵襲能力上升(P<0.05)，見圖1、圖2。這種負向調(diào)節(jié)的作用進一步說明了TUSC3在乳腺癌中的抑制作用，但它的作用機制還有待進一步研究。

腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是一個涉及多個步驟的過程，包括上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithel-mesenchymal transition，EMT)、局部侵襲、進入血管、通過血管遷移、外滲和在其他組織定植等，而EMT是腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的先決條件[7]。研究顯示，腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要因素之一是獲得EMT樣表型[3]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，TUSC3在結(jié)直腸癌[6]、卵巢癌[8]中發(fā)揮的作用均與EMT過程相關(guān)。EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化)是指上皮細胞通過逐漸喪失其細胞極性、細胞間緊密連接和黏附連接，使細胞增加侵襲力和遷移能力，并產(chǎn)生了大量細胞外基質(zhì)成分來抑制細胞凋亡，逐漸變成了具有間質(zhì)細胞形態(tài)和特性的細胞[9]。EMT主要的分子特征就是兩個關(guān)鍵分子表達的變化，即E-Cadherin下降，Vimentin表達上升。本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，敲減TUSC3表達后，E-Cadherin表達下降，Vimentin上升(P<0.05)，見圖3。符合EMT表型的分子特征。因此，我們認為敲減TUSC3表達后乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力增強可能與EMT相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，有幾種信號途徑與EMT過程相關(guān)：(1)MAPK通路：ERK通路、JNK通路、p38MAPK通路[10]；(2)TGF-β信號通路[11]；(3)Wnt/beta-catenin通路[12]；(4)NF-κB信號通路[13-14]；(5)Notch信號通路[15]；EMT相關(guān)細胞信號可以激活多條分子信號通路，而這些通路上的分子又可以激活EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達，互相作用。