GPX3過表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、遷移的影響

于成龍，李 冀，陳培劍，馮 瑩，于建渤

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心；2.黑龍江省腫瘤疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011)

甲狀腺癌是世界上最常見的內(nèi)分泌癌[1]，并且發(fā)病率在全球范圍內(nèi)繼續(xù)上升，主要是由于乳頭狀癌組織類型(PTC)的增加。約有10%～15%的PTC患者可能復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡[2]，因此，有必要充分了解PTC發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機(jī)制，能夠有效治療該疾病。大量研究表明，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)參與了許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

在GPXs家族中，GPX3是唯一在腎臟合成并主動(dòng)分泌到血漿中的胞外酶，GPX3可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，在清除過氧化氫和其他活性氧方面起著至關(guān)重要的作用[3-4]。但是 GPX3在甲狀腺癌中的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè) GPX3在BCPAP細(xì)胞株中的表達(dá)情況，探討GPX3對(duì)BCPAP細(xì)胞的增殖、遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 材料細(xì)胞株BCPAP購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(美國(guó)Gibco生物公司)；過表達(dá)的慢病毒載體和對(duì)照載體(上海和元生物技術(shù)股份有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本同仁)；BeyoClick EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)C0075S)(上海碧云天生物技術(shù)公司)；引物及設(shè)計(jì)與純化(上海生工生物工程股份有限公司)； RNA提取試劑盒(Omega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BCPAP細(xì)胞株在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，定時(shí)更換培養(yǎng)液。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 選擇狀態(tài)良好的BCPAP細(xì)胞株接種到6孔板及4個(gè)培養(yǎng)皿中，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按1×106/孔細(xì)胞及10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行鋪板，放入培養(yǎng)箱12 h后待細(xì)胞完全貼壁并且細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右后，更換血清培養(yǎng)基，分成兩組，按MOI值為10比例，第一組(GPX3-BCPAP組)加入過表達(dá)GPX3慢病毒到孔內(nèi)，第二組(NC-BCPAP組)加入空載病毒到孔內(nèi)，并且加入10 μL的Polybrene增加轉(zhuǎn)染效率，病毒感染8～12 h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，在24 h內(nèi)重新?lián)Q成10%胎牛血清完全培養(yǎng)基，再次放入培養(yǎng)箱，感染72 h后用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱來判斷慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的效率。

1.2.3 BeyoClick EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè) 應(yīng)用BeyoClick EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，最后用共聚焦顯微鏡觀察。并使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè) 將GPX3過表達(dá)及空載慢病毒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞按照3000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM制成單細(xì)胞懸液，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) GPX3過表達(dá)及空載慢病毒成功轉(zhuǎn)染后，將BCPAP細(xì)胞分別以1×105細(xì)胞/孔接種在6孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到大約90%時(shí)，使用無菌移液器吸頭有序的刮擦細(xì)胞瓶底部，用PBS清除刮擦后細(xì)胞，重新加入2 mL完全培養(yǎng)液。在刮擦后0 h、24 h，使用倒置顯微鏡(×200)拍攝并使用Image J軟件分別計(jì)算各組面積X0、X24；按照公式(X0-X24)/X0計(jì)算相對(duì)愈合面積，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)GPX3和Caspase-3表達(dá)情況 根據(jù)E.Z.N.A.TM HP Total RNA Kit說明書從培養(yǎng)細(xì)胞中分離獲得總RNA。并使用1 μg總RNA利用Transcriptor First Strand cDNA試劑盒進(jìn)行cDNA第一條鏈合成，再用Fast SYBR green PCR master mix(Roche)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，并且使用GAPDH作為內(nèi)部參照。引物序列見表1，反應(yīng)體系見表2。反應(yīng)條件：20 μL反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min。進(jìn)行44個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，依據(jù) 2-△△CT法計(jì)算mRNA各樣本相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 qRT-PCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量數(shù)據(jù)均是用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間差異性比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差分析，并進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染后的BCPAP細(xì)胞株形態(tài)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察到慢病毒成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示綠色熒光，表明NC-BCPAP組與GPX3-BCPAP組轉(zhuǎn)染成功,見圖1。

圖1 共聚焦顯微鏡下慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染后檢測(cè)BCPAP中GPX3 mRNA的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)在NC-BCPAP組和GPX3-BCPAP組中GPX3的表達(dá)，GPX3-BCPAP組(10.2173±2.0818)GPX3表達(dá)明顯高于NC-BCPAP組(0.7819±0.1019)(P<0.001)。

2.3 EDU-555檢測(cè)過表達(dá)GPX3抑制BCPAP細(xì)胞的增殖BeyoClick EdU-555結(jié)果顯示，與NC-BCPAP組(31.3260±19.1772)相比，GPX3-BCPAP組(12.4868±6.7064)EDU陽性染色細(xì)胞數(shù)量顯著降低，表明過表達(dá)GPX3是通過抑制細(xì)胞中DNA的合成的方式來抑制BCPAP細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)，見圖2。

圖2 共聚焦顯微鏡下BCPAP細(xì)胞的增殖能力(×200)

2.4 CCK-8檢測(cè)過表達(dá)GPX3抑制BCPAP細(xì)胞的增殖能力CCK-8結(jié)果顯示，GPX3-BCPAP組(0.3316±0.004)細(xì)胞的增殖能力低于NC-BCPAP組(0.4141±0.003)細(xì)胞增殖能力(P<0.05)。

2.5 過表達(dá)GPX3抑制BCPAP細(xì)胞的遷移能力劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GPX3-BCPAP組BCPAP細(xì)胞相對(duì)愈合面積(7.31±9.78)%明顯低于NC-BCPAP組(24.40±0.83)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)GPX3能抑制BCPAP細(xì)胞的遷移，見圖3。

圖3 熒光顯微鏡下各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的遷移能力(×200)

2.6 慢病毒轉(zhuǎn)染后檢測(cè)BCPAP中Caspase-3的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示GPX3-BCPAP組(21.644±6.149)Caspase-3表達(dá)明顯高于NC-BCPAP組(3.577±0.951)，表明過表達(dá)GPX3可能促進(jìn)BCPAP細(xì)胞的凋亡(P<0.05)。

3 討論

甲狀腺癌是近幾十年來所有實(shí)體腫瘤中增長(zhǎng)最快的癌癥。PTC是甲狀腺癌的最主要類型[5]，僅PTC占所有甲狀腺癌的85%左右，盡管手術(shù)和其他療法可以解決大多數(shù)情況，但患者的發(fā)病率很高，在某些情況下，腫瘤表現(xiàn)出更具侵略性的行為[6]，因此，必須全面了解PTC細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制，并確定新的治療靶點(diǎn)，以便對(duì)這種疾病進(jìn)行有效的治療，雖然在過去的幾十年里發(fā)現(xiàn)了越來越多的生物標(biāo)記物，但還沒有發(fā)現(xiàn)PTC的特異性生物標(biāo)記物，很明顯，惡性腫瘤的早期診斷是確保患者更好預(yù)后的關(guān)鍵，因此，迫切需要尋找對(duì)PTC患者具有治療和預(yù)后價(jià)值的有前途的生物標(biāo)志物。

GPX3是GPXs的一種分泌形式、硒蛋白，在血漿和粘膜表面很容易檢測(cè)到，是血漿中的主要抗氧化酶,它在活性氧進(jìn)入細(xì)胞之前對(duì)其進(jìn)行解毒[7]，并且GPX3是GPXs中唯一的胞外糖基化酶，GPX3在不同的腫瘤類型中起著雙重作用，既是腫瘤抑制蛋白，又是促生存蛋白,可催化還原型谷胱甘肽對(duì)水和可溶性脂質(zhì)過氧化氫的解毒作用[8]。來越多的證據(jù)表明，GPXs家族基因在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，特別是GPX3已被證實(shí)經(jīng)常異常表達(dá)，并與乳腺癌、肝癌、腎透明細(xì)胞癌[9]等多種人類癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)。Peng等人[10]利用qRT-PCR檢測(cè)了在9個(gè)胃癌細(xì)胞系中的8個(gè)檢測(cè)到GPX3的下調(diào)或沉默，通過刮擦傷口愈合試驗(yàn)檢測(cè)，胃癌細(xì)胞中GPX3高表達(dá)降低了細(xì)胞遷移的能力，Zhao[11]等人發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性PTC組織中GPX3的表達(dá)經(jīng)常降低或缺失，同樣，在本研究中，我們使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在BCPAP細(xì)胞株中高表達(dá)的GPX3的遷移能力降低，我們還通過CCK-8，BeyoClick EdU-555檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GPX3-BCPAP組細(xì)胞的增殖速率及增殖能力低于NC-BCPAP組，此外，利用qRT-PCR證實(shí)了與NC-BCPAP細(xì)胞組相比，GPX3-BCPAP組PTC的細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，此外，An等人[12]也在肺癌中發(fā)現(xiàn)GPX3能有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。經(jīng)過充分的研究，已被證實(shí)GPX3在大多數(shù)癌癥中起著抑癌作用，其可能作為預(yù)后生物標(biāo)志物的使用以及臨床干預(yù)的潛在靶標(biāo)[13]。

綜上所述，過表達(dá)的GPX3在PTC細(xì)胞中顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移，并且可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，可能有希望作為甲狀腺癌患者的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物，為開發(fā)有效的甲狀腺癌治療靶標(biāo)和生物標(biāo)志物提供了重要線索，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。