膠體金免疫層析技術檢測中獸藥非法添加化學藥品的應用

趙興鑫　田梅　趙義良　蘇青　呂潔　趙永坡　張吉

摘要：為快速有效地鑒定出中獸藥中非法添加的化學藥物，該文選取健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散4種常見的中獸藥散劑作為基質，分別添加不同濃度的沙丁胺醇和克倫特羅2種“瘦肉精”藥物，及氯霉素和四環素2種抗生素藥物，建立膠體金快速檢測方法。結果表明，在健胃散、白頭翁散、銀翹解散中添加10 μg/kg沙丁胺醇對照品，各個加標樣品檢測結果均為陽性;在清瘟敗毒散中分別添加2、3、5 μg/kg克倫特羅對照品，各個加標樣品檢測結果均為陽性，且有一定梯度;在健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散中添加10 μg/kg氯霉素對照品，各個加標樣品檢測結果均為陽性;在健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散中添加50 μg/kg四環素對照品，各個加標樣品檢測結果均為陽性。

關鍵詞：中獸藥;瘦肉精;抗生素;快檢;膠體金

中圖分類號：S853? ? ? ? ? 文獻標識碼：B? ? ? ? doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.001

Detection of Illegally Added Chemicals in Chinese Veterinary Drugs Based on Colloidal Gold Immunochromatography

Abstract：In order to quickly and effectively identify the illegally added chemical drugs in Chinese veterinary drugs，four common Chinese veterinary drugs，Jianwei powder，Baitouweng powder，Yinqiao powder and Qingwen Paidu powder，were selected as the substrates，the colloidal gold method was established by adding different concentrations of salbutamol and Clenbuterol，chloramphenicol and tetracycline，respectively.The experimental results showed that 10 μg / kg salbutamol reference substance was added to Jianwei powder，Pulsatilla powder and yinqiao powder，and the test results of each spiked sample were positive;2，3 and 5 μg/kg clenbuterol control samples were added to Qingwen Baidu powder respectively，and the test results of each spiked sample were positive with a certain gradient;10 μg/ kg chloramphenicol reference substance was added to Jianwei powder，Pulsatilla powder and Yinqiao Jiedu powder，and the test results of each spiked sample were positive;50 μg/kg tetracycline reference substance was added to Jianwei powder，pulsatilla powder and Yinqiao Jiedu powder，and the test results of each spiked sample were positive.

Keywords：Chinese veterinary medicine，clenbuterol，antibiotics，rapid detection，colloidal gold

引言

隨著全社會對食品安全問題的重視，在我國畜牧業領域進一步提出新的發展要求，其中在獸醫臨床中減少使用或代替化學合成類抗生素等藥物成為最重要的措施[1]，而中獸藥因具有低毒副作用、不易產生耐藥性等優點會越來越被廣泛地應用。

膠體金免疫層析法在具體檢驗期間所用原理為競爭抑制免疫層析，檢驗所用樣品中待測物在流動時結合膠體金標記特異性待測物單克隆抗體，對于抗體及硝酸纖維素膜檢測線上應用的待測物-BSA偶聯物結合產生一定的抑制效果，從而造成檢測線顏色發生不同程度的深淺變化[2]。當樣品中不含有待測物或濃度低于檢測限時，T線（測試線，testline）顯色強于C線（質控線，controlline），或者顯色與C線顯色之間未見明顯差異，如果和檢測限進行比較，樣品中的待測物濃度較高，則T線顯色會明顯弱于C線顯色，或者也表現為T線不顯色。

為了快速檢測出中獸藥中的違法添加物，擬通過膠體金免疫層析法，開展違法添加物的快速篩查檢測工作，通過與深圳市綠詩源生物技術有限公司聯合開展技術攻關，得到了適用于中獸藥中違法添加物快速篩查檢測的膠體金速測卡。

1 儀器與材料

沙丁胺醇、克倫特羅、氯霉素、四環素膠體金快速檢測卡（深圳市綠詩源生物技術有限公司），漩渦混合儀，離心機。實驗用樣本提取液（深圳市綠詩源生物技術有限公司），沙丁胺醇、克倫特羅、氯霉素、四環素對照品，健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散。

2 方法

取樣品（1±0.01）g，放入50 mL離心管中，加入40 mL樣本提取液，漩渦混合2 min，室溫下4 000 r/min離心5 min。取上清液2～3滴加入檢測卡樣品孔中，計時5 min后，直接目測結果。

3 結果與分析

3.1 基質干擾考察

膠體金免疫層析法對樣本的處理是有一定要求的，由于免疫反應是一種生物反應，最終滴加入檢測卡孔中的液體pH要在一定范圍內，通常為5～8，否則容易出現假陽性或無效的情況;而中獸藥散劑本身物質成分復雜，又具有較深的顏色，易造成干擾。在預實驗時針對樣本提取液（一定濃度的緩沖體系）和稀釋倍數做大量研究，最終確定該方法。可通過圖片清晰地看到健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散在基質狀態下試紙條顯示明顯的陰性，偶有淡黃色背景，但不影響結果判斷[3]。

3.2 加標實驗

健胃散、白頭翁散、銀翹解散，分別稱取1 g，定量加入0.01 mL沙丁胺醇（1 μg/mL）對照品，所添加對照品劑量與中藥散劑含量10 μg/kg相當，按照應用“2”方法處理分析，檢測所用工具為膠體金免疫層析檢測卡，分別記錄結果，見圖1，各個加標樣品檢測結果均為陽性，表明方法準確性良好。

分別稱取3份清瘟敗毒散各1 g，依次定量加入克倫特羅（0.1 μg/mL）對照品0.02、0.03、0.05 mL，相當于中藥散劑含量為2、3、5 μg/kg，按“2”方法處理后，應用膠體金免疫層析檢測卡進行檢測，分別記錄結果，見圖2，各個加標樣品檢測結果均為陽性，且有一定梯度，表明方法準確性良好。

健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散，分別稱取1 g，定量加入0.01 mL氯霉素（1 μg/mL）對照品，所添加對照品劑量相當于中藥散劑含量10 μg/kg，所用處理方式同樣為“2”方法，然后借助于膠體金免疫層析檢測卡展開檢測，分別記錄結果，見圖3，各個加標樣品檢測結果均為陽性，表明方法準確性良好。

健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散，分別稱取1 g，定量加入四環素（10 μg/mL）對照品，添加劑量為0.005 mL，與中藥散劑含量50 μg/kg相同，處理時應用“2”方法，所用檢測工具為膠體金免疫層析檢測卡，分別記錄結果，見圖4，各個加標樣品檢測結果均為陽性，表明方法準確性良好[4]。

4 討論

健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散4種中獸藥散劑在本實驗方法下檢測未出現假陽性或無效的情況，說明該方法的提取溶劑和稀釋倍數適合，減少色素及其他雜質的影響。在加入的藥物對照品的樣品中，均有檢出，呈現明顯的陽性結果，且檢測限均達到痕量級別，更進一步確保檢測結果的準確性。

該方法的優勢十分明顯，在具體應用期間所得檢測項目靈敏度與其他檢測手段可媲美，在實際應用期間可提前檢測大量樣本以及多個靶標物質，有利于進行違法行為的初步判定。膠體金免疫層析法主要優勢在于操作簡單、省時省力，和傳統方法進行比較，應用期間對于儀器設備要求較少，且檢測費用較低，所獲得的檢測結果直觀，適合基層條件下使用，具有廣闊的發展空間。

中獸藥散劑品類眾多，成分復雜，且在種植及炮制時有差異，而膠體金免疫技術易受樣本基質干擾，如樣品本身色素較多、pH值過低或過高、相似結構的雜質成分等因素，易出現假陽性或無效情況。為解決此類問題，需要調配合適的提取溶劑和調整合適的稀釋倍數來降低基質干擾。

5 結束語

膠體金快速檢測技術已經被廣泛使用在食源性動物的快速篩查上，技術成熟，商業化生產企業眾多。隨著相關部門對獸藥處方外非法添加的監管與打擊力度不斷加大，積極推進快檢方法的應用和適用范圍擴展。對中獸藥非法添加化學藥物進行快速有效地分析，提高各檢測機構的篩查能力，膠體金免疫層析技術是一種凈化中獸藥市場的可靠手段。

參考文獻

[1] 李明.我國獸藥產業現狀與發展趨勢[J].獸醫導刊，2018（19）：14-15.

[2] 李耀磊，劉麗娜，姚云，等.基于膠體金免疫層析技術對中藥材中黃曲霉毒素B_1的定量檢測研究[J].中國藥學雜志，2019，54（17）：1 432-1 437.

[3] 周媛，貢玉清，邵德佳.有關中獸藥中非法添加化學藥物的探討[J].中國畜牧獸醫文摘，2010，26（5）：36-37.

[4] 蔣海芬，韋勵平，韋俏娜.獸藥中非法添加物檢測新技術的應用[J].廣西畜牧獸醫，2015，32（2）：109-110.

基金項目：石家莊市科學技術研究與發展計劃項目（201500122A）;石家莊市科技創新團隊項目（208790026A）

作者簡介：趙興鑫（1985-），男，漢族，山東泰安人，碩士研究生，高級畜牧師，從事畜產品和獸藥飼料質量安全檢測方法的研究工作。