核磁共振磷譜定量測定肉制品中磷酸鹽的含量

韓 智，江 豐，周 密，張亞珍，龔 蕾，王會霞

(湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北武漢 430075)

多聚磷酸鹽是肉制品加工中常用的品質改良劑，有助于提高肉制品的保水性及嫩度，具有殺菌及抗氧化作用[1]。然而過量攝入磷酸鹽可能會危害人體健康，有研究表明動物(大鼠)攝入過量磷酸鹽會增加其患肺癌的風險[2]。目前我國批準使用的磷酸鹽食品添加劑共有18種[3]，在肉制品中廣泛使用的有三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽、焦磷酸鹽，三者通常按照不同比例混合使用[4]。《食品添加劑使用標準》規定在預制肉制品、熟肉制品、冷凍魚糜制品(包括魚丸等)中磷酸鹽最大使用量為5.0 g/kg(單獨或混合使用，以PO43-計)[3]。

目前有關磷酸鹽的國家及行業檢測標準有薄層層析法、鉬藍分光光度法、釩鉬黃分光光度法及離子色譜法[5-8]。文獻報道的檢測方法還有流動注射分析(FIA)結合分光光度法[9]、毛細管電泳法[10]、快檢試劑盒法[11]。然而，使用分光光度法時，需要通過消解將磷酸鹽全部轉換成正磷酸鹽再進行測定，無論通過濕法消解、干法灰化還是亞硫酸鈉還原，都無法測定除正磷酸鹽離子之外的其它種類離子。離子色譜法易受基質干擾影響，且需要經過多個步驟提取及凈化，耗費大量時間和試劑耗材，分析方法步驟繁瑣、耗時長，易受其它陰離子影響。毛細管電泳方法易受到緩沖液溶度、pH、分離電壓、溫度等各方面因素影響，遷移時間重現性較差。快檢試劑盒法雖不需要大型儀器，但其耗時長，準確度低。

近年來, 隨著核磁共振技術(nuclear magnetic resonance，NMR)的發展，越來越多的科研工作者使用NMR來進行目標化合物的定性及定量[12-13]。在NMR定性定量研究中，1H-NMR譜應用最為廣泛，其次是13C- NMR，31P-NMR應用較少，但是由于一般食品基質中含有31P原子的比例遠小于1H，對于不含P原子的物質，基本不存在基質效應，因此31P -NMR在定性和定量方面，相比于1H-NMR和13C-NMR具有很大的優勢[14]。

31P-NMR在食品分析中的應用廣泛，包括橄欖油等級鑒定、畜禽肉新鮮度鑒別、牛奶中甘油磷酰膽堿定量測定、酪蛋白中磷脂酰絲氨酸定量測定、淀粉來源辨別、果蔬中有機磷農藥定量測定等[15-18]。Stanley等[19]對市售的三聚磷酸鈉進行31P-NMR分析，鑒別出市售三聚磷酸鈉中含有焦磷酸鈉、三偏磷酸鈉、磷酸氫二鈉3種雜質，并定量測定其含量。Stanislawski等[20]使用31P-NMR定量測定三偏磷酸鈉、四偏磷酸鈉、磷酸氫二鈉、焦磷酸鈉，采集時間2 h，檢出限為200 mg/kg；說明31P-NMR可用于磷酸鹽的定量研究。

本研究詳細討論使用31P-NMR定量檢測肉制品中磷酸鹽的影響因素，選取六甲基磷酰三胺(hexamethylphosphoramide, HMPA)為內標的方法定量測定肉制品中磷酸鹽。本方法旨在提供一種簡便且不需要消耗有機試劑，不需復雜的提取及凈化等前處理過程，可在沒有標準品情況下快速定性定量測定肉制品中焦磷酸鹽、磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三聚磷酸鹽含量的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

重 水 美 國Cambridge Isotope Laboratories公司；HMPA 美國Sigma-Aldrich公司；三偏磷酸根、三聚磷酸根、磷酸根、焦磷酸根 濃度均為1000 mg/L，美國O2si公司；三偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉、磷酸鉀、焦磷酸鈉 純度≥98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硼酸、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鉀、氫氧化鈉 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Bruker Avance III HD 600 MHz波譜儀配備PABBO 600S3 BBF-H-D-05 Z SP探頭 德國布魯克公司；核磁管 5 mm，美國Norell公司；ICS-5000+型離子色譜儀 美國賽默飛世爾公司；230Volt型渦旋振蕩器 美國Talboys公司；S210型酸度計 美國梅特勒-托利多公司；S 180H超聲波清洗儀(功率為1000 W) 德國艾爾瑪公司；Milli-Q型超純水機 法國密理博公司；GM200型刀式研磨儀 德國萊馳公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核磁共振方法

1.2.1.1 堿性緩沖鹽配制 試劑1：硼酸-氯化鉀緩沖液(pH=9.0)。取硼酸3.09 g，用0.1 mol/L氯化鉀溶液500 mL溶解，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液210 mL。

試劑2：0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉。取29.224 g EDTA，加超純水900 mL，用10 mol/L的NaOH溶液調節pH到9.0，使其完全溶解，再定容到1 L。

堿性緩沖鹽：試劑1/試劑2(2/1，V/V)。

1.2.1.2 樣品前處理 參照文獻方法[21-22]并加以修改，取肉制品約100 g，切成約1 cm3的肉丁，用刀式研磨儀絞碎。稱取約5.00 g絞碎的樣品，加入堿性緩沖鹽10 mL，渦旋振蕩2 min，4 ℃下12000 r/min離心5 min，倒出上清液；用10 mL提取液重復提取并離心一次，合并兩次上清液，轉移到25 mL具塞比色管中，加入200 μL濃度為100 mg/mL的HMPA內標溶液，用堿性緩沖鹽定容到25 mL，取2～3 mL上清液過0.45 μm濾膜，為待測液。用移液槍精密移取450 μL待測液至核磁管中，精密移取50 μL重水于核磁管中，將二者混勻，上機檢測。

1.2.1.331P-NMR采樣參數31P-NMR采集條件：反轉門控去耦脈沖序列zgig，采樣點數TD：65536，掃描次數NS=64，延遲時間D1=12 s，采集時間AQ=1.9268 s，譜寬SW=70 ppm，O1P=5 ppm，O2P=4.7 ppm，P1=12 μs，增益RG=203，測定溫度298 K。采用線寬因子為0.3 Hz的窗函數對原始的自由感應衰減信號(FID)進行傅里葉變換得到頻域譜，然后用apk進行自動相位校正, abs進行自動基線平滑。

1.2.1.4 磷酸鹽含量的測定 采用式(1)計算待測樣品磷酸鹽的含量：

式中，mx為待測物含量；mstd為內標含量；Mx為待測物分子量；Mstd為內標分子量；Ax為待測物定量峰信號面積；Astd為內標物定量峰信號面積；nx為待測樣品定量峰包含的磷原子數；nstd為內標物包含的磷原子數。

1.2.2 方法學考察

1.2.2.1 精密度實驗 以火腿腸為基質，按照1.2.1的處理方法，同一樣品1 d內連續測定6次，計算平均值，分析方法的日內精密度；連續測定5 d，每天測定6次并取平均值，分析方法的日間精密度。

1.2.2.2 回收率實驗 平行稱取火腿腸樣品，用1.2.1的方法進行前處理。加入高中低三水平(0.50、2.0、5.0 g/kg)的磷酸鹽，每個水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差。

1.2.3 離子色譜法對比

1.2.3.1 前處理 參照GB 5009.256-2016的方法[8]。稱取2.5 g火腿腸樣品，用50 mmol/L氫氧化鈉溶液洗入100 mL 比色管中混勻定容至刻度，80 ℃超聲提取30 min，每隔 5 min 振搖一次, 保持固定相完全分散。冷卻至室溫后, 溶液經濾紙過濾; 取濾液于4 ℃下，8000 r/min 離心10 min，取上清液備用。取濾液15 mL，通過0.45 μm水性濾膜針頭過濾器、Ag柱和Na 柱，棄去前7 mL，收集后面洗脫液待測。

1.2.3.2 色譜分析條件 使用DionexIonPac AS19型離子色譜柱(4 mm×250 mm) ，檢測條件為：柱溫30 ℃；流速1. 0 mL /min；進樣量25 μL；氫氧化鉀溶液梯度淋洗，0～10 min，25～60 mmol/L，10～28 min，保持60 mmol/L，28～30 min，60～25 mmol/L，30～35 min，保持25 mmol/L。

1.3 數據處理

數據處理使用TopSpin、MestReNova、Office及Origin軟件。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取試劑的選擇 比較了不同pH的緩沖鹽及超純水對肉制品中磷酸鹽的提取效果。以1.0 mg/mL的焦磷酸鈉為例，比較了其在pH=4.5醋酸緩沖鹽、pH=7.0的超純水、pH=9.0的硼酸緩沖鹽下的化學位移(δ，ppm)，分別為δ=-9.40 ppm、δ=-7.4 ppm、δ=-6.50 ppm，實驗結果顯示pH越大，其化學位移越大。在實際樣品中，相同磷酸鹽的化學位移會因為pH不同而導致化學位移變化，從而造成峰歸屬分類錯誤，因此不適合使用水去提取磷酸鹽，而需采用緩沖鹽提取。由于磷酸鹽在酸性條件下容易發生水解，因此本實驗最后選擇pH=9.0的硼酸緩沖鹽保持樣品提取溶液pH穩定，進行磷酸鹽提取。本實驗還以焦磷酸鈉和焦磷酸鉀為例，比較了鈉鹽和鉀鹽的化學位移，在相同pH下，其化學位移相同。

2.1.2 凈化方式 比較了C18固相萃取、Ag/H固相萃取小柱、CHCl3有機試劑沉淀、直接離心過膜上機共4種方法對磷酸鹽測定含量的影響，結果表明4種方法測得的結果無顯著性差異，說明31P-NMR在測定磷酸鹽時，抗干擾能力強，無需復雜前處理即可進行測定。

2.2 NMR實驗參數的選擇

2.2.1 內標物的選擇 用于qNMR理想的內標應滿足以下條件：內標的定量峰與待測樣品的定量峰分離良好，易溶于測試溶劑，不與待測樣品相互作用。常見的定量內標物有磷酸氫二鉀、六甲基磷酰三胺、亞甲基二磷酸、磷酸三苯酯、三苯基膦等。不同磷酸鹽的化學位移δ分布在5.0～-25.0 ppm，故宜選取內標物的化學位移δ大于10 ppm。綜合考慮，本實驗選取六甲基磷酰三胺(HMPA)為內標，其化學位移為29.91 ppm(使用H3PO3校準)，與各目標化合物分離度好。4種磷酸鹽和內標的圖譜如圖1所示。

圖1 磷酸鹽的31P-NMR圖譜Fig.1 31P-NMR spectra of phosphates

2.2.2 延遲時間D1使用標準序列t1irpg測定各化合物的弛豫時間T1，各化合物的T1如表1所示。一般認為當延遲時間D1≥5T1時，目標化合物的響應達到最大，此時定量準確。按照一般性要求，本實驗D1的值需要設定為55 s。但過大的D1會導致單次掃描時間增加，分析時間顯著加長。為了縮短單次掃描耗時間，本實驗研究了在相同掃描次數下，D1分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、12、14、16、18、20、25、30、50、60 s時各化合物的的響應強度，實驗結果表明當D1在0.1～12 s時，信號逐漸增強，但在12 s后信號無顯著性差異(P>0.05)，因此本實驗將D1設為12 s。

表1 各化合物的弛豫時間(T1)Table 1 Relaxation time (T1) of each compound

2.3 方法學考察

2.3.1 方法準確度分析 核磁定量分為外標法和內標法，本實驗使用3種不同方法驗證方法的準確性。配制4種磷酸鹽(以陰離子根計)的混合標準曲線為40、100、300、500、800、1000、1500、2000 μg/mL，內標加入濃度為800 μg/mL。方法①：以4種磷酸鹽定量峰信號強度為縱坐標y，以濃度為橫坐標x，進行線性回歸繪制曲線。方法②：以4種磷酸鹽與內標物定量峰的信號強度比為縱坐標y，以4種磷酸鹽與內標物濃度比為橫坐標x軸，進行線性回歸繪制曲線。方法③：使用內標絕對測定法(即本文的1.2.1.4公式)，利用HMPA的峰面積和質量計算出其它4種磷酸鹽的含量。

實驗結果表明使用①和②時，y與x均成線性，且決定系數R2>0.999，線性方程及決定系數見表2。由表2看出31P-qNMR信號響應穩定，濃度與定量峰面積成正比。使用方法③內標定量，HMPA峰面積計算PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的含量分別為實際含量的112.0%、102.5%、103.2%、101.8%，表明該方法使用外標法和內標法計算結果均準確。使用內標絕對測定法不需要4種磷酸鹽的標準品，且一次采集就可定量4種不同磷酸鹽，因此文章選擇第3種方法進行精密度、回收率等方法學實驗。標準圖譜及化學位移見圖1標注，實際樣品圖譜見圖2。

圖2 實際樣品的31P-NMR圖譜Fig.2 31P-NMR spectra of samples

表2 各化合物的線性方程及決定系數Table 2 Linear equations and coefficients of determination of compounds

2.3.2 精密度分析 參照吉鑫等[23]定量測定食品中水蘇糖的精密度分析方法并加以改動。按照本文1.2.2.1的方法進行測試，采用HMPA內標法測定肉制品中磷酸鹽的日內精密度為0.68%～3.55%，日間精密度為1.12%～4.51%，且日內與日間兩者磷酸鹽測定結果無顯著性差異，方法精密度高。

2.3.3 回收率實驗 采用本文1.2.2.2的方法進行測定。往基質中添加高中低三水平的磷酸鹽，每個水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差。結果如表3所示，采用HMPA內標法測定肉制品中磷酸鹽的回收率為97.0%～112.0%，RSD為0.87%～3.15%。

表3 加標回收率及相對標準偏差Table 3 standard addition recoveries and relative standard deviations of the methods

2.3.4 檢出限 肖坤等[24]在使用1H-NMR測定食用油中的脂肪酸時指出qNMR方法的定量限很難達到英國藥典要求的S/N≥150，并認為依據中國藥典四部通則(2015版)規定，以信噪比為 3 或 2 時的相應濃度確定檢出限。本研究使用31P-NMR也難以達到S/N≥150的要求，因此本研究未明確評價定量限，以信噪比 S /N≥2確定檢出限。依照1.2.1.3的方法測試，掃描時間為14 min 53 s，PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的檢出限分別為0.15、0.15、0.15、0.30 g/kg。

2.3.5 方法比對 使用1.2.1的核磁共振方法和1.2.3離子色譜法分別對10份市售火腿腸進行含量測試，結果如表4所示，兩種檢測方法的含量無顯著性差異，進一步驗證31P-NMR方法準確、可靠。結果也表明在肉制品中磷酸鹽含量普遍較高，這與文獻的報告結果一致[4]。

表4 不同檢測方法的含量對比Table 4 Content comparison of different detection methods

3 結論

本研究以HMPA為內標，利用31P-NMR方法，加標回收率為97.0%～112.0%，相對標準偏差0.87%～3.15%。日內精密度為0.68%～ 3.55%，日間精密度為1.12%～4.51%。該方法與離子色譜法[8]相比不需消耗有機試劑，不需復雜的提取及凈化等前處理過程，在沒有標準品情況下，可快速定性定量測定肉制品中焦磷酸鹽、磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三聚磷酸鹽，單個樣品的檢測時間為14 min 53 s，與離子色譜法[8]單個樣品檢測時間60 min相比，極大縮短了檢測時間，檢測效率顯著提高，是一種新穎的檢測方法，對肉制品中磷酸鹽的定量測定具有很好的準確性和廣泛的適用性。然而31P-qNMR也存在一定的缺陷，比如靈敏度不高，對微量成分進行準確定量仍存在難度，需進一步開發適合31P檢測的高靈敏度的探頭；并且核磁共振設備的普及率遠不及其它色譜儀器，限制了這項技術的廣泛應用。但是，隨著核磁技術的不斷進步、靈敏度不斷的提高，定量核磁共振技術必然會迎來廣闊的應用前景。