響應面法優化結晶麥芽制備工藝

趙川艷，尹永祺，楊正飛，方維明

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州 225127)

結晶麥芽是特種麥芽[1]的重要品種之一，屬于焙烤麥芽，是指胚乳部分能夠呈現出穩定的水晶、玻璃狀的麥芽顆粒[2]。結晶麥芽內部核心的堅硬玻璃質能夠賦予啤酒更好的口感，并增加其醇厚性、非生物穩定性[3]、泡持性和麥芽香味[4]。結晶麥芽在發芽工序上區別于普通麥芽之處在于其需要將發芽后的綠麥芽完整地進行預糖化，然后在高溫下焙烤完成[5-6]。預糖化工藝分為蛋白質休止和糖化兩個階段，在此工藝過程中，麥芽中的蛋白質和淀粉分別在蛋白酶和淀粉酶的作用下分解為氨基酸和糖類，為后續焙焦過程中的美拉德反應[7-10]和焦糖化反應[11-12]做準備。美拉德反應的底物是由綠麥芽糖化過程中內源酶制劑降解淀粉和蛋白質形成的，該過程是麥芽中糖類物質和氨基酸積累的關鍵環節，同時也對結晶麥芽后續焙焦過程中結晶物質的形成有著重要影響[13]。焙焦階段是麥芽色、香、味形成的重要階段[5,14-16]，焙焦溫度和時間的合理搭配能夠提高麥芽的品質，繼而提高啤酒的品質[17-18]。當前，國內對結晶麥芽的生產工藝研究較少，具體制備工藝條件尚不明確，而且國內所使用的結晶麥芽主要依賴于進口，國內少量的結晶麥芽普遍存在結晶率不高、結晶品質不佳等缺陷，所以從結晶麥芽的生產工藝入手來優化結晶麥芽的品質至關重要[19]。

本研究優化制備適合用于結晶麥芽的綠麥芽，進一步通過單因素實驗和響應面法[20]分析優化預糖化工藝和焙焦工藝，增加結晶麥芽的結晶率，提升其結晶品質，以期為國內優質結晶麥芽的工業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳麥 市售結晶麥芽，永順泰(寶應)麥芽有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、果糖、碘酸鉀、乙醇、甘氨酸、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、L-酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、可溶性淀粉、乙酸、乙酸鈉、硫酸、硫代硫酸鈉、四硼酸鈉、碘化鉀、百里酚酞(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；食品級乳酸 上海瑞祥生物科技有限公司。

PGX-250型恒溫恒濕培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；BGT-8A糖化儀 杭州博日科技有限公司；UV752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；pHS-25 pH計 上海雷磁儀器有限公司；HC-2066高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；MA-110-3H水分含量測定儀 蘇州坤宏科技有限公司；T1-L1O1B烤箱 美的集團股份有限公司；090834TS高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 結晶麥芽制備工藝流程 大麥清洗除雜→浸麥→發芽→綠麥芽預糖化→排潮→焙焦→除根→成品結晶麥芽

1.2.2 綠麥芽發芽時間選擇 稱取300 g除雜后的大麥洗凈，恒溫恒濕培養箱溫度為16 ℃，濕度為95% RH，采用浸四斷八[21]的浸麥方式浸麥。浸麥48 h后，于15 ℃下避光發芽。分別發芽24、36、48、60、72、84和96 h，在發芽過程中每隔6 h補水使大麥保持濕潤最終得到綠麥芽。

取不同發芽時間的綠麥芽25 g，加入100 mL蒸餾水在65 ℃下糖化1 h。之后取5 g糖化好的綠麥芽，加入50 mL蒸餾水，用攪拌器粉碎，在8000×g下離心15 min，取上清，測定游離氨基氮與還原糖含量。

1.2.3 綠麥芽預糖化工藝優化

1.2.3.1 蛋白質休止階段單因素實驗 將發芽3 d的綠麥芽浸入糖化水中，分別在40、45、50、55、60 ℃下進行蛋白質休止1.5 h(pH為6.5)；用食品級乳酸調節糖化水至不同的pH(分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5)，在45 ℃下進行蛋白質休止1.5 h；溫度固定為45 ℃(pH自然)，蛋白質休止時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。取樣測定游離氨基氮含量。

1.2.3.2 綠麥芽糖化階段單因素實驗 將發芽3 d的綠麥芽浸入糖化水中，分別在50、55、60、65和70 ℃下糖化1.5 h(pH為6.5)；用食品級乳酸調節糖化水至不同的pH(分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5)，在65 ℃下糖化1.5 h；固定糖化溫度為65 ℃，pH為6.5，分別進行糖化0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。取樣測定還原糖含量。

1.2.3.3 綠麥芽糖化階段響應面試驗 基于單因素實驗結果，根據Box-Behnken試驗設計原理采用響應面法確定綠麥芽預糖化工藝中糖化階段的最優工藝參數。以溫度(A)、pH(B)和時間(C)為自變量，還原糖含量(Y)為響應值，進行三因素三水平的響應面優化試驗。響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test

1.2.4 焙焦階段工藝優化

1.2.4.1 單因素實驗 將預糖化好的綠麥芽在90 ℃下干燥1 h使其凋萎，分別在100、110、120、130、140和150 ℃下焙焦20 min；固定焙焦溫度為120 ℃，分別焙焦10、15、20、25、30 min，分別取樣測定麥芽水分含量、結晶率和色度。

1.2.4.2 響應面試驗 基于單因素實驗結果，為得到結晶率最高且色度范圍在130～160 EBC之間的結晶麥芽的最優工藝參數，根據中心組合試驗設計(CCD)原理采用響應面法確定焙焦階段的最佳工藝條件。以焙焦溫度(A)和焙焦時間(B)兩個因素為自變量，水分含量、結晶率、色度為響應值，進行兩因素三水平的響應面優化試驗。響應面試驗設計因素與水平見表2。

表2 響應面試驗設計因素水平表Table 2 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 指標測定 游離氨基氮含量：參考茚三酮方法[22]進行測定；還原糖含量：采用DNS光度法[23]進行測定；水分含量：使用快速水分含量測定儀進行測定[24]；色度：按照歐洲啤酒協會的檢測方法，采用分光光度法測定[11]；浸出物：參考QB/T 1686-2008《啤酒麥芽》密度瓶法[22]；糖化力：參考QB/T 1686-2008《啤酒麥芽》糖化力的測定方法[22]；麥汁pH：參考焦健[25]的總酸含量的測定方法；結晶率[26]：隨機數100粒結晶麥芽用剪刀沿著腹溝剪開，觀察內部結晶程度；

計算方法：大于1/2的結晶質算作1粒，小于1/2的結晶質算作半粒。

式中：x：一粒結晶質數，單位為粒；y：半粒結晶質數，單位為粒。

1.3 數據處理

實驗進行3次平行，測定結果采用Microsoft Excel和Origin 8.5統計處理和作圖，利用DPS 7.05軟件對實驗數據進行隨機單因素方差分析，采用Tukey多重比較法進行顯著性檢驗。利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面實驗進行設計、分析并繪制響應曲面。

2 結果與分析

2.1 綠麥芽發芽時間的選擇

如圖1所示，大麥在發芽24～72 h時，游離氨基氮與還原糖含量持續升高，72 h時達到最高，分別達到432.91 mg/L、109.40 g/L，而后開始下降。這是因為發芽72 h時麥芽中蛋白酶的酶量與活性較高，游離氨基氮的含量處于較高水平，這與周蕓蕓等[27]的研究基本一致。在發芽后期，麥粒中的各種酶被激活來降解大麥中的淀粉、蛋白質和纖維素，利用這些降解的小分子物質去合成新的細胞并生長出根芽和葉芽[28]。所以，選擇發芽72 h的綠麥芽作為制備結晶麥芽的原料，有利于在結晶麥芽制備過程中形成更多的還原糖和氨基酸，進而提高結晶率和增加美拉德產物。

圖1 綠麥芽糖化后游離氨基氮和還原糖含量的變化Fig.1 Changes of free amino nitrogen and reducing sugar content after green malt saccharification

2.2 綠麥芽預糖化工藝優化

2.2.1 單因素實驗 圖2中A、B、C三圖為綠麥芽預糖化工藝中蛋白質休止階段的單因素實驗結果，D、E、F三圖為糖化階段的單因素實驗結果。結果表明，在45 ℃時，綠麥芽中的蛋白酶能夠更好地將麥芽中的蛋白質分解成氨基酸，使得游離氨基氮含量顯著增高(P<0.05)，達841.21 mg·L-1(圖2A)。圖2B表明，pH的變化對蛋白質休止無顯著影響(P>0.05)；圖2C中蛋白休止時間在0.5～1.5 h游離氨基氮含量顯著增加(P<0.05)，但在1.5 h后，游離氨基氮的含量無顯著變化(P>0.05)，所以蛋白休止時間選擇1.5 h較為合適。

圖2 預糖化工藝中溫度、pH和時間對蛋白質休止和糖化效果的影響Fig.2 The influence of temperature, pH and time on protein resting and saccharification effect in pre-saccharification process

如圖2D所示，還原糖含量在50～70 ℃之間變化顯著(P<0.05)，65 ℃時，綠麥芽的還原糖含量最高，達到110.28 g·L-1；由圖2E可知，pH為6時，綠麥芽的還原糖含量最高；所以可以初步確定糖化階段的最適溫度為65 ℃，最適pH為6.0。圖2F表明，糖化時間在0.5～2.0 h之間還原糖含量顯著增加(P<0.05)，但在2.0 h后，還原糖的含量增加無顯著變化(P>0.05)，所以糖化時間選擇2.0 h較為合適。

2.2.2 綠麥芽糖化階段響應面試驗

2.2.2.1 響應面試驗設計 基于單因素實驗，采用Box-Behnken模型，以還原糖含量Y為響應值，對溫度(A)、pH(B)和時間(C)進行三因素三水平的響應面優化試驗，試驗結果見表3。

表3 預糖化工藝響應面設計及結果Table 3 Design and results of response surface methodology of pre-saccharification process

2.2.2.2 建立多元二次回歸方程與顯著性檢驗表 通過Design-Expert軟件，對表3中的試驗數據進行分析，擬合得出結晶麥芽糖化工藝中還原糖含量(Y)關于溫度(A)、pH(B)、時間(C)的多元二次回歸方程：

由回歸方程可以看出，三項因素對指標值的影響程度為A>C>B。

通過表4可知，R2為0.9972，R2Adj為0.9936，說明模型的預測值和實際值吻合度較好[29]。選擇的模型差異極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，說明該線性回歸方程的模型擬合可用于預測綠麥芽糖化。通過顯著性檢驗P值的大小可以得到溫度、pH和時間這三個因素中，溫度對于糖化效果的影響極顯著(P<0.001)，溫度、pH和時間的交互作用對糖化效果均無顯著影響(P>0.05)。響應面圖和等高線圖顯示各因素的變化趨勢與回歸模型的方差分析結果相吻合(圖3)。

表4 Box-Behnken 試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Behnken experiment

圖3 兩因素交互作用對還原糖含量影響的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of the influence of two factors interaction on reducing sugar content

2.2.2.3 模型驗證試驗 綠麥芽預糖化工藝中糖化階段的最佳條件為：溫度為66.35 ℃，pH為6.01，時間為2.02 h。因考慮到實際操作情況，調整最佳工藝條件為溫度為66.4 ℃，pH為6.0，時間為2.0 h。在此工藝條件下進行驗證實驗，得到的還原糖含量實測值為135.23 g·L-1，相對于單因素實驗，糖化效果得到明顯優化。

2.3 焙焦階段工藝優化

2.3.1 單因素實驗 將凋萎的綠麥芽分別在100～150 ℃下焙焦10～30min，不同焙焦溫度和時間下水分含量、結晶率和色度的變化如圖4所示。圖4A表明水分含量隨焙焦溫度的升高而降低，且在100～130 ℃差異顯著(P<0.05)。焙焦結束時，麥芽的水分含量應達到5%以下[30]，如圖4A所示，焙焦溫度在130～150 ℃范圍內，水分含量均達到要求。由圖4B可看出焙焦溫度在130 ℃時，結晶率達到最高，且差異顯著(P<0.05)，但高于140 ℃時結晶率降低，說明焙焦溫度不宜過高；由圖4C可知，色度隨焙焦溫度的升高而升高，且存在顯著性差異(P<0.05)；焙焦溫度在120～130 ℃時，色度在130～160 EBC范圍內。圖4D表明隨著焙焦時間的增加(10～20 min)，水分含量顯著降低(P<0.05)，結晶率和色度顯著升高(P<0.05)；焙焦30 min水分含量能達到5%以下，且結晶率最高，達到98%，色度也在120 EBC以上。因考慮到實際情況，焙焦溫度過高或焙焦時間過長都會導致麥芽烤焦，所以選擇焙焦溫度120～140 ℃，焙焦時間25～30 min用于響應面試驗設計。

圖4 焙焦溫度和焙焦時間對水分含量、結晶率和色度的影響Fig.4 Effects of baking temperatures and baking time on moisture content, crystallinity and chromaticity

2.3.2 響應面試驗結果

2.3.2.1 中心組合試驗設計 試驗設計方案及結果見表5。

2.3.2.2 建立多元二次回歸方程與顯著性檢驗表 對表5中的試驗數據進行回歸分析，擬合得出結晶麥芽焙焦工藝中焙焦溫度(A)和焙焦時間(B)對水分含量、結晶率和色度的二次回歸方程：

表5 焙焦工藝響應面設計及結果Table 5 Design and results of response surface methodology of baking process

由表6可知，三個模型的R2和R2Adj均較為接近，說明模型的預測值和實際值吻合度較好，且模型差異極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，表明模型有很好的預測性[31]。表6表明，焙焦溫度對水分含量和色度有極顯著影響(P<0.001)，對結晶率有非常顯著影響(P<0.01)；焙焦時間對色度有極顯著影響(P<0.001)，對水分含量有非常顯著影響(P<0.01)；焙焦溫度和時間的交互作用對色度具有極顯著影響(P<0.001)。

表6 水分含量、結晶率和色度的方差分析Table 6 Variance analysis of moisture content, crystallization rate and chromaticity

2.3.2.3 模型驗證試驗 利用Design-Expert軟件進行分析，得到結晶麥芽的最佳焙焦工藝為：溫度127.23 ℃，時間26.86 min，預測理論值：水分含量3.69%(指標標準在5%以下)，結晶率98.8%(最大值100%)，色度159.6 EBC(范圍在130～160 EBC)。結合實驗可操作性，將最優焙焦工藝實驗參數確定為溫度127 ℃，時間27 min，按照此工藝條件進行驗證實驗，得到水分含量、結晶率和色度的平均值分別為3.75%、99%和158.9 EBC，與預測值相差較小，進一步驗證了該回歸模型較為合理有效。

2.4 結晶麥芽品質分析

結晶麥芽表皮呈金黃色或焦黃色，與市售結晶麥芽相比，本工藝制備的結晶麥芽顆粒更加飽滿、均勻、有光澤(圖5B)。將結晶麥芽剖開，其胚乳部分呈現棕色或黑棕色的結晶狀。本工藝制備的結晶麥芽內部能夠完全結晶(圖5D)，而市售結晶麥芽只有部分結晶(圖5C)。從表7中可以看出，市售結晶麥芽和本工藝制備結晶麥芽在糖化力、麥汁pH上差別不顯著(P>0.05)，但游離氨基氮的含量顯著提高了24.4%(P<0.05)，還原糖含量和浸出率也比市售結晶麥芽顯著高出16.5%和10.3%(P<0.05)。本工藝制備的結晶麥芽整體的結晶率也高于市售的結晶麥芽。經過工藝優化后，結晶麥芽的品質得到了明顯的改善。

表7 結晶麥芽質量指標對比Table 7 Comparison of quality indicators of crystalline malt

圖5 市售結晶麥芽(A、C)與本工藝制備結晶麥芽(B、D)的外觀圖和剖面圖Fig.5 Appearance and cross-sectional views of commercially available crystalline malt(A,C) and crystalline malt (B,D)prepared by this process

3 討論

結晶麥芽的主要生產工序是使已經充分溶解的綠麥芽蛋白質休止、糖化、排潮、高溫焙焦。蛋白質休止過程是麥芽中的羧基肽酶分解多肽形成氨基酸(α-氨基氮)和利用內切肽酶分解蛋白質形成多肽和氨基酸的過程。麥芽中主要蛋白酶的最適作用溫度[31]為40～55 ℃，形成α-氨基氮的最適溫度為45～50 ℃，所以蛋白質休止最適溫度為45 ℃。pH的變化對蛋白質休止無顯著影響(P>0.05)，是由于在麥芽中含有酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶[32]，使其對pH敏感性變小，從而導致pH的變化對蛋白休止無顯著影響。

糖化是在存在于綠麥芽中的α-淀粉酶與β-淀粉酶[33]的共同作用下完成的[14]，其中α-淀粉酶的最適pH為5.7～5.9，β-淀粉酶的最適pH與α-淀粉酶大體相同，而且其最適溫度為50～55 ℃。但由于糖化時使用的是完整的綠麥芽，大麥皮殼的保護導致麥芽內部的溫度與環境存在差異，所以可使糖化階段的最適溫度為66.4 ℃，最適pH為6.0。糖化結束升溫至90 ℃進行排潮處理，麥芽內部初步發生美拉德反應；排潮結束后的高溫焙焦過程可使麥芽內部還原性糖脫水縮合發生焦糖化反應[12]，并伴隨發生美拉德反應[34-35]，生成呈色呈香類物質，結晶麥芽中內部結晶的形成也發生在此過程。Coghe等[9]研究得出麥芽色度的形成取決于焙焦溫度和時間，這是由于焙焦溫度越高，類黑精的生成量也越多[36]。結晶麥芽要求的色度越高，所需要相應的焙焦溫度越高，時間也越長，所以應根據實際需求來調整最適的焙焦溫度和時間的組合。對于結晶麥芽的色度范圍，目前并沒有明確的標準。淺色結晶麥芽的色度一般在50～80 EBC，深色結晶麥芽在280～320 EBC左右，用于釀造一定色度的啤酒時，淺色結晶麥芽的著色能力相對較差，所以添加量相對較高，這可能會對麥芽糖化過程中的糖化力產生不利影響[37]；深色結晶麥芽添加不當則會對啤酒的著色情況和風味方面(如焦苦味的產生)產生影響[38]；李琳娜等[39]利用色度在120～140 EBC的焦香麥芽釀造出來的啤酒色澤明亮，泡沫細膩持久，麥芽香氣濃郁，口感醇厚柔和，品質較好。綜上所述，本研究選擇優化生產色度范圍在130～160 EBC的結晶麥芽，此色度范圍內的結晶麥芽在啤酒釀造時既能夠更好的著色，且不影響調色時的糖化力，也不會對啤酒風味產生不利影響。

4 結論

本研究通過單因素實驗和響應面試驗優化得到綠麥芽預糖化工藝和焙焦工藝的最佳工藝參數：將綠麥芽在45 ℃下蛋白質休止1.5 h，在66.4 ℃，pH為6.0的條件下糖化2.0 h可使得綠麥芽中游離氨基氮和還原糖含量達到最高。進一步在127 ℃下焙焦27 min，可得到水分含量為3.75%、色度為(158.9±1.19)EBC、結晶率高達99%的結晶麥芽，且該結晶麥芽內部能夠完全結晶，結晶品質較高，與市售結晶麥芽相比，其游離氨基氮含量、還原糖含量和浸出率也得到了顯著提高(P<0.05)，整體品質得到改善。