響應面法優化霞多麗與赤霞珠混合釀造葡萄酒工藝

黃志蕓，史金涵，霍歸國，杜欣芮，張 繼,

(1.西北師范大學生命科學學院, 甘肅蘭州 730070；2.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術研究中心, 甘肅蘭州 730070)

桃紅葡萄酒，又名玫瑰紅葡萄酒，是口味和顏色上介于紅、白兩者之間的葡萄酒，同時具備紅、白葡萄酒的特點，酒體輕盈，口感清爽，近年來非常受消費者的歡迎[1-2]。桃紅葡萄酒主要是將葡萄漿果進行浸漬[3]，通過控制浸漬時間和溫度，使得適量的花色苷和單寧等物質浸入到果汁中，并通過發酵、過濾、澄清、陳釀等工藝釀造而成。

近年來，中國已成為葡萄酒的生產和消費大國[4]。面對進口葡萄酒激烈的市場競爭，國內葡萄酒企業迎難而上，不斷壯大。伴隨消費需求的個性化和多元化不斷增強，消費者對于新種類果酒產品的需求日漸高漲[5-6]。但是，我國與傳統產酒國相比，葡萄酒品類單一，以紅葡萄酒為主，桃紅葡萄酒市場占有率極低，導致市場上葡萄酒風格的同質化，背離了葡萄酒的個性化和多樣化的產品屬性[7]。

目前，國內對于桃紅葡萄酒的研究主要集中在以美樂、巨峰、赤霞珠和玫瑰香等單一品種發酵方面，單一品種通過浸漬發酵或浸漬壓榨后進行清汁發酵釀造桃紅葡萄酒。操慶國等[8]以巨峰葡萄為原料，控制初始總糖含量150 mg/L和總二氧化硫濃度80 mg/L，在18 ℃下浸漬發酵3 d，經澄清、陳釀后酒體顏色最佳，呈玫瑰紅色；伍國明等[9]以赤霞珠為原料，在浸漬果漿的SO2質量濃度為80 mg/L，酵母添加量0.2 g/L，果膠酶添加量0.07 g/L時，低溫15 ℃下浸漬26 h，經常規工藝處理后得到的桃紅葡萄酒香氣突出，酒體協調；孟強等[10]以“媚麗”為原料，考察浸漬溫度、酒精發酵溫度和是否進行蘋果酸乳酸發酵(malolactic fermentation，MLF)對桃紅葡萄酒的影響，結果表明，當低溫浸漬、常溫酒精發酵且不進行乳酸發酵時，桃紅葡萄酒的綜合得分最高；崔艷等[11]以玫瑰香為低溫浸漬原料，考察浸漬溫度和時間對低醇桃紅葡萄酒品質的影響，結果表明，當浸漬溫度6 ℃，浸漬時間48 h時所釀造的葡萄酒呈淺桃紅色，口感均衡，低溫浸漬增加了低醇葡萄酒的水果香和花香。國外桃紅葡萄酒的研究比較流行的方法有Ripasso 法和“放血法”(saignée)。Lukic'等[12]采用Ripasso 法向葡萄醪液添加不同比例葡萄皮的方式控制葡萄酒的色度、香氣和酚類物質；Leticiam等[13]考察不同“放血”比例對桃紅葡萄酒品質的影響，結果表明，隨著“放血”比例的增加，桃紅葡萄酒的亮度增加，香氣更濃郁，抗氧化性能更高。

混釀法是將兩種或兩種以上的葡萄原料按照一定比例混合后，采用浸漬發酵或前期混合浸漬后壓榨取汁進行清汁發酵?；旌厢勗旒夹g可以避免單一葡萄品種釀造桃紅葡萄酒時色度不易控制、酒體單薄、香氣不足等現象。南海龍等[14]將壓榨后的公主白和北冰紅山葡萄清汁單獨進行低溫發酵，發酵后的原酒按照一定比例混合，經澄清、陳釀后得到的桃紅山葡萄酒香氣優雅、復雜性提升，并且該工藝操作簡單，更容易控制桃紅葡萄酒的色度；張如意[15]以新疆瑪納斯產區小芒森葡萄和貴人香葡萄為原料,研究了單品種釀造后調配和完全混合發酵技術對葡萄酒的品質的影響，結果表明，發酵前期調配混釀能夠增加葡萄酒香氣成分和促進酒體結構的融合,對于提高混釀葡萄酒的品質有積極作用。霞多麗釀造的酒其果香味淡雅細膩，回味悠長，是目前全世界最受大家歡迎的釀造白葡萄酒的白葡萄品種之一[16]。赤霞珠釀造的干紅葡萄酒顏色較深、濃郁厚重[17]。單寧酸含量較高的赤霞珠混合一定比例的霞多麗可以柔化口感，增進酒體的平衡性和豐富性。因此，以霞多麗和赤霞珠為原料混合浸漬后釀造桃紅葡萄酒，對豐富我國葡萄酒的產品種類、增加葡萄資源利用途徑、提高葡萄酒產品的質量和競爭力，具有非常重要的現實意義。

本研究以霞多麗和赤霞珠為原料，采用混釀法釀造桃紅葡萄酒，選取原料配比、浸漬溫度和浸漬時間三個因素，以花色素苷含量和感官評分為評價指標，通過單因素和響應面試驗，對桃紅葡萄酒混合釀造工藝進行優化，以期為桃紅葡萄酒的生產尋求新途徑以及工業化生產提供一定的理論和實踐數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成熟度八九分的霞多麗和赤霞珠當季冷藏葡萄 產自河北張家口；白砂糖 市售；酵母 葡萄酒酵母EC1118，丹麥LALVIN；鹽酸、乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、亞硫酸鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、碘化鉀、硼酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、甲醇 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；次甲基藍、酚酞(指示劑) 上海安普實驗科技股份有限公司；菲林溶液甲、乙液 阿拉丁試劑網；果膠酶(35000 U/g)、偏重亞硫酸鉀 煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

FAI1204B電子分析天平 山海精科天美貿易有限公司；0～40%vol酒精度計 武強縣億達儀表廠；溫度計 零度儀器儀表有限公司；LC-DR-53B數顯糖度計 上海力辰科技有限公司；SPHs-3c型精密pH計 上海理達儀器廠；LRH-250F生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 霞多麗、赤霞珠→分選→清洗→除梗破碎→調硫→靜置浸漬→酶解(果膠酶)→皮渣分離→調節糖度→接種酵母→主發酵→倒酒陳釀→低溫澄清→過濾→調配→殺菌→灌裝→成品

操作要點：預處理：將兩種葡萄手工除梗破碎，按照一定比例混合后，迅速加入10倍軟化水溶解的偏重亞硫酸鉀，以免葡萄汁發生氧化或者受到雜菌污染，二氧化硫添加量控制在150～250 mg/L[18]；靜置浸漬：通過浸漬作用，可以將葡萄果皮中的花色素苷和單寧等物質浸出到葡萄果汁中，增加葡萄果汁的顏色和風味物質。在17～29 ℃條件下對混合葡萄漿浸漬15～27 h；加入果膠酶：在浸漬過程中加入0.02%的果膠酶(果膠酶使用前按果膠酶∶水=1∶10 的比例，在 35 ℃的溫水中攪拌活化 30 min)，加速果汁的澄清和提高出汁率；皮渣分離：浸漬結束后進行粗過濾和榨汁，避免葡萄果皮中的單寧等物質浸出過度，影響葡萄酒的口感；調節糖度：添加適量白砂糖使得葡萄發酵液可溶性固形物含量達到24 °Bx；發酵：加入0.3 g/L葡萄酒酵母EC1118，將稱好的酵母在38 ℃下使用酵母質量 10 倍的2%蔗糖水溶液進行 30 min活化，在14～26 ℃條件下進行主發酵，當液面平靜不再產生氣泡，殘糖含量不再下降時，說明主發酵結束[19]；陳釀：將分離后得到的酒液在15 ℃下密封陳釀30 d，為避免氧化作用，應盡量滿瓶封藏，以減少酒體和空氣的接觸；低溫澄清：在陳釀后的酒液中加入皂土(用其質量10倍的水對皂土進行浸泡12 h)，在4 ℃條件下靜置澄清15 d。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 不同原料配比對桃紅葡萄酒釀造的影響 固定二氧化硫添加量200 mg/L，浸漬時間21 h，浸漬溫度23 ℃，發酵溫度20 ℃，考察霞多麗與赤霞珠在混合比例為0.5∶1、0.8∶1、1∶1、1∶0.8、1∶0.5時對桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分的影響。

1.2.2.2 不同浸漬時間對桃紅葡萄酒釀造的影響 固定原料配比1∶1，二氧化硫添加量200 mg/L，浸漬溫度23 ℃，發酵溫度20 ℃，考察浸漬時間為15、18、21、24、27 h時對桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分的影響。

1.2.2.3 不同浸漬溫度對桃紅葡萄酒釀造的影響 固定原料配比1∶1，二氧化硫添加量200 mg/L，浸漬時間21 h，發酵溫度20 ℃，考察浸漬溫度為17、20、23、26、29 ℃時對桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分的影響。

每組實驗測定3次取平均值，以桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分為指標，研究各個單因素對桃紅葡萄酒發酵情況的影響，并確定最適單因素條件。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，選取原料配比A、浸漬時間B、浸漬溫度C為考察因素，應用Box-Behnken實驗設計原理，以感官評分Y為響應值，進行三因素三水平響應面分析實驗，進一步優化釀造工藝參數，因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels in the response surface methodology

1.2.4 指標測定 花色素苷測定：pH示差法[20]；總酸(以酒石酸計)測定：電位滴定法；總糖(以葡萄糖計)、還原糖(以葡萄糖計)測定：直接滴定法；總黃酮：依據GB/T15038-2006測定[21]；酒精度測定：酒精計法[22]；揮發酸(以乙酸計)[23]。

1.2.5 感官評分 挑選15名經過專業酒類感官培訓的成員組成感官品評小組，參照GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法，以及Martínez等[24]的方法，對桃紅葡萄酒的色澤、香氣、滋味、典型性進行感官評定，具體評分標準如表2所示(滿分100分，作圖時換算為10分制)。

表2 感官評分標準Table 2 Criteria of sensory evaluation

1.3 數據處理

采用Design-Expert 10進行響應面試驗設計與分析，采用Excel、GraphPad Prism 8進行數據處理和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同原料配比對桃紅葡萄酒花色素苷含量與感官評分的影響 由圖1可知，不同的原料配比直接影響桃紅葡萄酒的花色素苷含量與感官評分，隨著赤霞珠添加比例的增大，復合后的葡萄汁花色素苷含量不斷增加，這是由于赤霞珠花色素苷含量較高所導致的；而感官評分隨著赤霞珠添加比例的增大出現先升高后下降的趨勢，但當兩者比例在(1∶1)時，其感官評分最高，其后又出現了品質下降的現象。由于桃紅葡萄酒要求其色澤不宜過深或淺，最佳顏色呈粉紅色[25]，又因為在原料配比為1∶0.5時的感官評價低于0.8∶1，因此選取0.8∶1～1∶0.8范圍的比例為宜，綜合考慮以原料配比1∶1為最適條件。

圖1 原料配比對桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分的影響Fig.1 Influence of raw material ratio on anthocyanin content and quality in rose wine

2.1.2 不同浸漬時間對桃紅葡萄酒花色素苷含量與感官評分的影響 桃紅葡萄酒中浸漬時間的長短會直接影響花色素苷和單寧的浸出量，進而影響到桃紅葡萄酒的色澤和口感[26]。由圖2可知，桃紅葡萄酒的感官評分隨著浸漬時間的延長呈現出先增加后減少的趨勢，但是花色素苷的含量隨浸漬時間的延長不斷增加。當浸漬時間低于21 h時，花色素苷和感官評分隨浸漬時間升高而升高；當浸漬時間高于21 h時，感官評分隨浸漬時間延長而降低。原因是當浸漬時間過長時大量花色素苷浸出，使葡萄酒的顏色加深，口感的滿足程度降低。當浸漬時間在21 h時，感官評價達到最高的8.6分，且浸漬時間18～24 h范圍時桃紅葡萄酒顏色最佳，所以選擇21 h為最適浸漬時間。

圖2 浸漬時間對桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分的影響Fig.2 Influence of immersion time on anthocyanin content and quality in rose wine

2.1.3 不同浸漬溫度對桃紅葡萄酒花色素苷含量與感官評分的影響 桃紅葡萄酒中浸漬溫度的高低會直接影響花色素苷和單寧的浸出速度，進而影響到桃紅葡萄酒的色澤和口感[27]。由圖3可知，桃紅葡萄酒的感官評分隨著浸漬溫度的上升呈現出先增加后減少的趨勢，而花色素苷的含量一直增加。當浸漬溫度小于23 ℃時，花色素苷和感官評分隨溫度升高而升高；當溫度大于23 ℃時，感官評分隨溫度升高而降低，這是因為是在大于23 ℃的條件下，花色素苷和單寧浸出速度加快，影響了桃紅葡萄酒的色澤和口感，酒體顏色加深，失去桃紅葡萄酒特有的粉紅色澤，收斂性口感加重；浸漬溫度在20～24 ℃范圍時，感官評分在7.5分以上，花色素苷含量在80～120 mg/L，這對于桃紅葡萄酒來說是比較適宜的，綜合考慮選取浸漬溫度23 ℃為最適條件。

圖3 浸漬溫度對桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分的影響Fig.3 Influence of immersion temperature on anthocyanin content and quality in rose wine

2.2 響應面試驗優化結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果 在單因素實驗結果的基礎上，確定原料配比A、浸漬時間B、浸漬溫度C為因素，以感官評分Y為響應值，采用Designexpert8.0軟件設計三因素三水平響應面試驗，結果見表3。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Response surface methodology design and results

2.2.2 回歸方程擬合與方差分析 對表3試驗數據進行多元回歸擬合，得到原料配比A、浸漬時間B、浸漬溫度C三個因素與感官評分的多元二次回歸方程：

由表4回歸方程方差分析結果可知，該回歸模型顯著性檢驗P<0.0001，表明多元二次模型具有極顯著意義，失擬項P=0.1082>0.05，不顯著，表明其他因素對模型的干擾影響小[28]，該回歸模型擬合情況良好；總決定系數R2=98.34%和調整決定系數R2Adj=96.22%均大于0.9，說明預測值與實驗值有較好的相關性[29]，因此，該回歸方程能基本擬合桃紅葡萄酒的實驗結果，并能利用此模型對釀造工藝條件進行分析與預測。

表4 回歸方程方差分析結果Table 4 Analysis of variance of regression equation

在此模型中，交互項BC、二次項A2、B2及C2均對感官評分的影響表現為極顯著作用(P<0.01)，一次項C具有顯著作用(P<0.05)；比較F值可知，各因素對復合桃紅葡萄酒釀造工藝過程影響作用按主次順序排列為：浸漬溫度(C)>浸漬時間(B)>原料配比(A)。

2.2.3 響應面結果分析 響應面圖是響應值對應的因素構成的三維空間在二維平面上的等高圖[30]，可直觀反映各因素的交互作用、最佳水平范圍以及對響應值的影響[31]。以回歸方程為依據，繪制各因素交互作用的響應面圖，考察原料配比、浸漬時間和浸漬溫度的交互作用對感官評分的影響，結果見圖4。

交互圖中的曲線坡度陡峭，等高線呈橢圓形，都表明該因素的交互作用對響應值的影響大[32]。由圖4可以看出，隨著浸漬溫度的上升和浸漬時間的延長，感官評分呈現先升高后降低的趨勢，等高線呈橢圓形狀，且曲線坡度陡峭，說明浸漬溫度和浸漬時間交互作用顯著，與方差分析結果一致；隨著赤霞珠添加量占比增大，感官評分明顯增加且下降趨勢明顯，說明原料配比對感官評分影響明顯高于其他指標，但與其他因素交互作用不明顯。

圖4 原料配比、浸漬時間和浸漬溫度交互作用對桃紅葡萄酒感官評分影響的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of the effects of feeding ratio, impregnation time and impregnation temperature on sensory score of rose wine

2.2.4 最佳工藝條件的確定與驗證實驗 通過Design Expert軟件實驗優化結果，綜合考慮感官評分和花色素苷含量，得到最佳釀造工藝條件為原料配比0.994∶1，浸漬時間21.26 h，浸漬溫度22.18 ℃，在此條件下預測最高感官評分為93.24，結合實際操作情況，將最佳參數修改為原料配比1∶1、浸漬時間21 h、浸漬溫度22 ℃，按照此工藝參數進行三次平行驗證實驗，得到桃紅葡萄酒感官評分91.00分，實驗結果與預測值基本接近，說明此模型能夠很好的模擬桃紅葡萄酒的實際情況，證實了模型的有效性。

2.3 桃紅葡萄酒的理化指標測定結果

由表5可知，按照優化后的釀造工藝生產的桃紅葡萄酒還原糖含量(以葡萄糖計)1.78 g/L；總糖含量(以葡萄糖計)3.69 g/L；揮發酸含量(以乙酸計)0.46 g/L；總酸含量(以酒石酸計)5.42 g/L；酒精度12.8%vol；花色苷含量93.4 mg/L，總黃酮含量475.8 mg/L，果酒各項指標檢測結果均符合GB/T15037-2006《葡萄酒》的標準要求。

表5 優化釀造工藝后桃紅葡萄酒的各項指標Table 5 Indicators for rose wine after optimized fermentation process

3 結論

本試驗將赤霞珠和霞多麗混合浸漬釀造桃紅葡萄酒，研究了兩者的添加比例、浸漬時間和浸漬溫度三個方面對桃紅葡萄酒花色素苷含量和感官評分的影響。通過單因素實驗和響應面設計分析，確定了桃紅葡萄酒的最佳釀造工藝參數為原料配比1∶1、浸漬時間21 h、浸漬溫度22 ℃。在此條件下，桃紅葡萄酒感官評分可達91.00分，與模型預測值93.24基本接近，證實了模型的有效性和可靠性，且各項基本理化指標均符合國家標準，混合釀造的桃紅葡萄酒同時具備了霞多麗酒和赤霞珠酒的優點，與單一品種釀造的桃紅葡萄酒相比，香氣更加優雅，口感更加柔和，酒體復雜性提升，更容易受到消費者的青睞。說明混合發酵工藝能夠提高桃紅葡萄酒的質量，開辟桃紅葡萄酒的釀造新途徑，對于桃紅葡萄酒的發展壯大有促進作用。