對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的抑制作用及機(jī)理

于洋君，伍 菱,2,3，何君竹，倪 輝,2,3，楊遠(yuǎn)帆,2,3,

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門(mén) 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén) 361021；3.廈門(mén)市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門(mén) 361021)

隨著生活水平的逐漸提高和生活方式的改變，肥胖已經(jīng)成為人類(lèi)面臨的主要健康問(wèn)題之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，2016年，全世界共有19億成年人超重，超過(guò)3.4億兒童和青少年超重或肥胖。超重人群(包括肥胖人群)已占全球人口的三分之一，中國(guó)的肥胖人群居世界首位[1]。肥胖和超重會(huì)增加人們患糖尿病、心血管疾病和癌癥等慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。預(yù)防肥胖的方法之一是減少脂肪在人體內(nèi)的消化吸收。

胰脂肪酶(EC 3.1.1.3)由胰腺腺泡細(xì)胞分泌，是消化脂肪的關(guān)鍵酶，因此，可通過(guò)抑制胰脂肪酶來(lái)降低腸道中脂肪的消化和分解，從而達(dá)到減少脂肪吸收，控制和治療肥胖的目的[3-4]。目前，奧利司他是唯一一種被美國(guó)食品藥物管理局批準(zhǔn)并用于治療肥胖癥的胰脂肪酶抑制劑[5]，但由于是人工合成類(lèi)藥物，服用者可能會(huì)出現(xiàn)腹瀉、胃腸不適、內(nèi)分泌失調(diào)等不良反應(yīng)，長(zhǎng)期服用會(huì)造成人體肝和腎的嚴(yán)重?fù)p害[6]。所以，從植物中篩選副作用小的胰脂肪酶抑制劑逐漸成為研究熱點(diǎn)。

羥基肉桂酸及其衍生物是廣泛存在水果、蔬菜等植物中的一類(lèi)酚酸類(lèi)物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抑菌、降脂等生物活性功能[7]。對(duì)羥基肉桂酸乙酯是羥基肉桂酸的一種衍生物，同樣具有抗氧化[8]、美白[9]和抗炎[10]的作用，但其是否有降脂的生物活性功能尚不明確。基于此，課題組前期從茶花粉中分離出了對(duì)羥基肉桂酸乙酯，證明了它的胰脂肪酶抑制作用，但尚未進(jìn)一步研究其抑制機(jī)制。為明確其抑制機(jī)理，本文通過(guò)酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)確定其抑制類(lèi)型，采用分子對(duì)接技術(shù)初步探討對(duì)羥基肉桂酸乙酯與胰脂肪酶的主要作用位點(diǎn)，以期為開(kāi)發(fā)胰脂肪酶抑制劑及降脂功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對(duì)羥基肉桂酸乙酯 本課題組從茶花粉中分離純化所得[11]，經(jīng)高效液相色譜儀檢測(cè)其純度為98.25%；奧利司他、胰脂肪酶(來(lái)自豬胰EC 3.1.1.3，25000 U/mg)、4-硝基苯基丁酸酯(p-NPB) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；對(duì)硝基苯酚(PNP)、甲醇(分析純)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)、二甲基亞砜(DMSO)、無(wú)水氯化鈣 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

EL104型電子分析天平 梅特勒-托利(上海)有限公司；SY-2-4型電熱式恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Epoch2T型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；QL-901型振蕩器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

1.2.1.1 溶液配制 Buffer A：稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)6.05 g，溶于450 mL蒸餾水中，用鹽酸緩慢滴定至pH=7.0，加入2.775 g的無(wú)水氯化鈣并使其充分溶解，待溶液冷卻至室溫，定容至500 mL備用。

Buffer B：稱取3-嗎啉丙磺酸(MOPS)1.05 g，溶于450 mL蒸餾水，加入100 μL 0.5 mol/L EDTA的NaOH溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)至pH=6.8，待溶液冷卻至室溫，定容至500 mL備用。

底物p-NPB溶液的配制：稱取4-硝基苯基丁酸酯(p-NPB)12.55 mg，溶于10 mL二甲基亞砜(DMSO)，配制成濃度為6 mmol/L的p-NPB溶液。

胰脂肪酶液的配制：稱取胰脂肪酶10 mg，加入2 mL Buffer B緩沖液溶解，配制成濃度為300 U/mL的酶溶液，-4 ℃、10000 r/min條件下離心5 min，取上清液1 mL，加入2 mL Buffer B稀釋為100 U/mL的胰脂肪酶溶液。

對(duì)羥基肉桂酸乙酯溶液的配制：精確稱取一定量的對(duì)羥基肉桂酸乙酯，用甲醇稀釋成濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的對(duì)羥基肉桂酸乙酯溶液。奧利司他作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.1.2 胰脂肪酶抑制率測(cè)定 取1700 μL的Buffer A、60 μL的胰脂肪酶溶液(100 U/mL)和不同濃度的對(duì)羥基肉桂酸乙酯溶液(0、10、20、30、40、50 μg/mL)于2 mL離心管中，于37 ℃恒溫水浴鍋中溫育15 min，取出后加入40 μL底物p-NPB(6 mmol/L)，再次放入37 ℃恒溫水浴鍋中溫育15 min后取出，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度[12]。以不加對(duì)羥基肉桂醛乙酯溶液的甲醇溶液為空白對(duì)照，以?shī)W利司他(濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照。按照公式(1)計(jì)算對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的抑制率。

式中：A1為胰脂肪酶+樣品測(cè)得的吸光度值；A2為Buffer B + 樣品測(cè)得的吸光度值；A3為胰脂肪酶+甲醇測(cè)得的吸光度值；A4為Buffer B+甲醇測(cè)得的吸光度值。

1.2.2 對(duì)羥基肉桂酸乙酯抑制胰脂肪酶的酶動(dòng)力學(xué)特征

1.2.2.1 PNP溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取對(duì)硝基苯酚(PNP)0.007 g，用Buffer B緩沖溶液溶解并定容至10 mL，得到濃度為5 mmol/mL的PNP母液。用Buffer B緩沖溶液將母液稀釋成濃度分別為90、80、70、60、50、40、30、20、10 μmol/mL的PNP溶液，以Buffer B緩沖液為空白對(duì)照，分別取上述濃度的PNP溶液各200 μL至96微孔板中，用酶標(biāo)儀在405 nm下測(cè)定吸光度值，每個(gè)濃度做3個(gè)平行并取平均值。以不同的PNP溶液檢測(cè)濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制PNP溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 可逆作用類(lèi)型的確定 參考Chai等[13]的方法，測(cè)定對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的抑制動(dòng)力學(xué)，通過(guò)固定底物p-NPB(6 mmol/L)的濃度，測(cè)定不同對(duì)羥基肉桂酸乙酯濃度(0、20、30、40、50 μg/mL)對(duì)不同濃度胰脂肪酶(0、60、80、100、120 U/mL)的酶促反應(yīng)初速度。以胰脂肪酶溶液濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速度為縱坐標(biāo)作圖。根據(jù)所得線性擬合曲線是否通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)判斷胰脂肪酶的抑制類(lèi)型。

1.2.2.3 競(jìng)爭(zhēng)作用類(lèi)型的確定 固定胰脂肪酶濃度為100 U/mL，改變底物p-NPB濃度(0、1、2、4、6、8 mmol/L)，分別測(cè)定不同濃度對(duì)羥基肉桂酸乙酯(0、20、30、40、50 μg/ mL)的酶促反應(yīng)速度，以p-NPB溶液底物濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，擬合得到的直線在x、y軸上的截距分別代表米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax的倒數(shù)。抑制常數(shù)Ki可通過(guò)斜率與抑制劑濃度進(jìn)行二次作圖計(jì)算可得。根據(jù)直線與坐標(biāo)軸交點(diǎn)位置判斷胰脂肪酶的抑制類(lèi)型[14]。

1.2.3 分子對(duì)接 從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.pdb.org/)中下載胰脂肪酶 (PDB ID: 1GPL)的晶體結(jié)構(gòu)[15]，底物p-NPB和抑制劑對(duì)羥基肉桂酸乙酯的三維結(jié)構(gòu)通過(guò)美國(guó)國(guó)力生物技術(shù)信息中心(NCBI)獲得。對(duì)接前分別對(duì)受體蛋白和配體進(jìn)行刪除水分子、加氫等處理，通過(guò)Discovery Studio、AutoDock 4.2等分子對(duì)接軟件進(jìn)行分子對(duì)接[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，采用Excel 2013及Origin Pro 9.0作圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的抑制作用結(jié)果

由圖1可知，對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶有抑制作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(10～50 μg/mL)，隨著其質(zhì)量濃度的增加，對(duì)胰脂肪酶抑制作用增強(qiáng)，通過(guò)線性擬合計(jì)算其半抑制濃度IC50為41.07 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照奧利司他IC50值為0.76 μg/mL。相比于其他天然產(chǎn)物中提取到的胰脂肪酶抑制劑，例如，王遠(yuǎn)等[17]用微波輔助提取法獲得的辣木葉黃酮(IC50值為0.94 mg/mL)、孔霄等[18]研究的地參游離酚(IC50值范圍為2.0305～3.0427 g/L)、褚盼盼等[6]研究的苦蕎麥多糖(IC50值為28.23 mg/mL)，對(duì)羥基肉桂酸乙酯表現(xiàn)出較強(qiáng)的胰脂肪酶抑制作用。

圖1 對(duì)羥基肉桂酸乙酯和奧利司他對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

2.2 對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的酶動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 PNP溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以不同濃度的

PNP溶液為橫坐標(biāo)，測(cè)定的吸光度值為縱坐標(biāo)，所得的PNP溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，PNP溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0046x+0.0127，R2=0.9949，其中x為對(duì)硝基苯酚溶液的濃度，y為試樣的吸光度值。通過(guò)該公式可以計(jì)算出不同吸光度對(duì)應(yīng)的對(duì)硝基苯酚，進(jìn)而測(cè)定胰脂肪酶活性。

圖2 對(duì)硝基苯酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of PNP solution

2.2.2 可逆抑制類(lèi)型的確定 根據(jù)抑制劑與酶的結(jié)合方式不同，抑制類(lèi)型分為可逆抑制和不可逆抑制。當(dāng)抑制類(lèi)型為不可逆抑制類(lèi)型時(shí)，不同抑制劑濃度下的酶促反應(yīng)速度曲線不通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)，曲線會(huì)相交于y軸；當(dāng)抑制類(lèi)型為可逆抑制時(shí)，不同抑制劑濃度下的酶促反應(yīng)速度曲線均會(huì)通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)，且加抑制劑的曲線斜率比不加抑制劑時(shí)低[19]。由圖3可知，在不同胰脂肪酶濃度下，每條線性擬合的曲線均通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)，且隨著對(duì)羥基肉桂酸乙酯濃度的增加，其斜率逐漸降低，說(shuō)明對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶屬于可逆型抑制[20]，是通過(guò)非共價(jià)鍵的形式與酶結(jié)合，進(jìn)而引起胰脂肪酶活力的降低或喪失[21]。

圖3 對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Inhibition kinetics curve of ethyl p-hydroxycinnamate toward pancreatic lipase

2.2.3 競(jìng)爭(zhēng)抑制類(lèi)型的確定 可逆型抑制分為競(jìng)爭(zhēng)型抑制、非競(jìng)爭(zhēng)型抑制和混合型抑制[22]。通過(guò)Lineweaver-Burk作圖進(jìn)一步確定可逆抑制類(lèi)型[23]。由圖4可知，直線斜率隨對(duì)羥基肉桂酸乙酯濃度的增大不斷增大，且相交于Y軸，表明對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的作用類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)型抑制[24]。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征，可以推斷，對(duì)羥基肉桂酸乙酯作為抑制劑在與胰脂肪酶結(jié)合的時(shí)候與底物競(jìng)爭(zhēng)活性中心的結(jié)合位點(diǎn)，從而達(dá)到抑制效果。計(jì)算得對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的最大反應(yīng)速率Vmax為2.61 μmol/L·min。圖5為不同濃度對(duì)羥基肉桂酸乙酯的雙倒數(shù)斜率對(duì)樣品濃度進(jìn)行的二次作圖，計(jì)算得抑制常數(shù)Ki=114.35 μg/mL。在競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型中，酶的抑制常數(shù)可以表示酶和抑制劑絡(luò)合物的解離常數(shù)，Ki值的大小能夠反映酶和抑制劑絡(luò)合物的解離難易程度，反映了抑制劑對(duì)酶的抑制能力大小[25-26]。單萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸對(duì)胰脂肪酶的抑制作用類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制(半抑制率IC50值為1.87±0.05 mg/mL，抑制常數(shù)Ki=0.68±0.03 mg/mL)；Polzonetti等[27]發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷對(duì)胰脂肪酶具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制，半抑制率IC50值為0.41 mmol/L，抑制常數(shù)Ki=0.19 mmol/L。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基肉桂酸乙酯的抑制常數(shù)較小，表明酶與其絡(luò)合物更難解離，對(duì)胰脂肪酶的抑制能力較強(qiáng)。

圖4 對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plots for inhibition of ethyl p-hydroxycinnamate on pancreatic lipase

圖5 對(duì)羥基肉桂酸乙酯濃度對(duì)曲線斜率的影響Fig.5 The inpact of ethyl p-hydroxycinnamate concentration to curve slope of pancreatic lipase

2.3 分子對(duì)接

采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步研究對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的抑制機(jī)理，并根據(jù)對(duì)接后的結(jié)合能來(lái)確定最佳結(jié)合方式，根據(jù)結(jié)合自由能越低，物質(zhì)結(jié)合的越緊密，結(jié)合的狀態(tài)越穩(wěn)定的原理[28-29]，最優(yōu)分子對(duì)接模擬結(jié)果如圖6所示，對(duì)羥基肉桂酸乙酯和底物p-NPB均可在胰脂肪酶的活性中心相結(jié)合。

圖6 對(duì)羥基肉桂酸乙酯與胰脂肪酶的分子對(duì)接模型Fig.6 Docking results between ethyl p-hydroxycinnamate and pancreatic lipase

對(duì)底物p-NPB和對(duì)羥基肉桂酸乙酯與胰脂肪酶對(duì)接的結(jié)果分別進(jìn)行研究，得到p-NPB和對(duì)羥基肉桂酸乙酯與受體胰脂肪酶結(jié)合的3D和2D圖。研究結(jié)果表明，p-NPB(圖7A)和對(duì)羥基肉桂酸乙酯(圖8A)均可進(jìn)入胰脂肪酶的活性位點(diǎn)與酶活性中心氨基酸殘基相互作用。如圖7(B)所示，底物p-NPB與酶活性中心氨基酸殘基Phe77、Ile209、Ala178和Leu213形成范德華力；與His263和Ser152形成氫鍵；與Pro180和Tyr114形成疏水作用力；與Phe215形成π鍵相互作用。當(dāng)加入抑制劑對(duì)羥基肉桂酸乙酯時(shí)，其結(jié)合的氨基酸和作用力發(fā)生改變。從圖8(B)可知，抑制劑對(duì)羥基肉桂酸乙酯與氨基酸殘基Ile209、Glu179、Leu153和Thr78形成范德華力；與胰脂肪酶催化三聯(lián)體[30]中的Ser152和His263形成氫鍵；與Tyr181、Pro180和Ala178形成疏水作用力；與Tyr114和Phe215形成π鍵相互作用；與Phe77形成C-H鍵。與底物p-NPB相比，增加了范德華力和疏水作用力。

對(duì)比圖7(B)和圖8(B)可知，抑制劑對(duì)羥基肉桂酸乙酯和底物p-NPB所結(jié)合的胰脂肪酶活性位點(diǎn)的氨基酸類(lèi)似，如：Phe77、Ile209、Ala178、His263、Ser152、Pro180、Tyr114和Phe215，說(shuō)明對(duì)羥基肉桂酸乙酯可以與p-NPB競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，通過(guò)占據(jù)酶的活性中心，導(dǎo)致底物p-NPB無(wú)法進(jìn)入活性口袋，從而引起酶活力降低，為競(jìng)爭(zhēng)型抑制[31]，此分子對(duì)接結(jié)果與抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果一致。雖然結(jié)合的氨基酸殘基類(lèi)似，但是其作用力不同，這可能是導(dǎo)致對(duì)羥基肉桂酸乙酯比底物p-NPB更易與酶結(jié)合的原因。

圖7 底物p-NPB與胰脂肪酶作用的3D(A)和2D(B)結(jié)構(gòu)模型圖Fig.7 3D (A) and 2D (B) structural simulation of p-NPB interacting with pancreatic lipase

圖8 對(duì)羥基肉桂酸乙酯與胰脂肪酶作用的3D(A)和2D(B)結(jié)構(gòu)模型圖Fig.8 3D (A) and 2D (B) structural simulation of interacting with pancreatic lipase

3 結(jié)論

本研究采用從茶花粉中分離得到的對(duì)羥基肉桂酸乙酯，研究其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用及抑制機(jī)理。研究結(jié)果表明，天然產(chǎn)物對(duì)羥基肉桂酸乙酯表現(xiàn)出潛在的胰脂肪酶抑制活性，其IC50為41.07 μg/mL。酶抑制動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明，對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶的作用類(lèi)型為可逆競(jìng)爭(zhēng)型抑制，其最大反應(yīng)速率為2.61 μmol/L·min，抑制常數(shù)Ki=114.35 μg/mL。分子對(duì)接結(jié)果表明，對(duì)羥基肉桂酸乙酯可以與胰脂肪酶結(jié)合，并與底物p-NPB競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心位點(diǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了對(duì)羥基肉桂酸乙酯對(duì)胰脂肪酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制的結(jié)論。此研究為對(duì)羥基肉桂酸乙酯的降脂機(jī)制及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用茶花粉提供了理論依據(jù)。