通關藤的適宜采收期研究

韓 俊，沈雪梅，龍光強，余 珊，楊丕瓊，張峪榕

（1.云南農業大學農學與生物技術學院，昆明 650201；2.昆明市農業科學院，昆明 650034）

通關藤［Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn］為蘿藦科牛奶藤屬多年生攀援木質藤木植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區的云南、廣東、福建、臺灣、貴州等地［1］。通關藤始載于《滇南本草》，其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清熱解毒、止咳平喘、降壓、保肝、抗癌等功效［2，3］。通關藤中含有機酸、多糖、生物堿、樹脂、色素及甾體苷等多種化學成分，其中C21甾體類是其主要化學成分，被現代醫學認為是具有抗腫瘤作用的主要活性物［4，5］。臨床采用通關藤總苷片、通光素、通關藤苷元甲治療慢性氣管炎［5］。目前，通關藤在食管癌、宮頸癌、急性白血病等多種病癥的治療方面也具有獨特優勢［6，7］。

隨著近年來對通關藤的開發利用，以通關藤為原料制成的消癌平口服液、注射液、顆粒劑、膠囊等中成藥被廣泛應用于臨床，對胃癌、肝癌、肺癌、食管癌等各類惡性腫瘤療效較顯著［8-10］，同時科研人員對藥用植物通關藤的關注度倍增。研究工作多集中在原植物考證、生物學特性、地理分布特點、野生資源及野外生境、無性繁殖、有性繁殖、抗性研究、化學成分分析及方法和臨床藥理學等方面，而從通關藤的產量和質量研究其最佳采收期的報道較少。

中藥材的種類繁多，用藥部位也有所不同，對應的最佳采收時間也不同，最佳采收時間是針對藥材的質量和產量而言的。中藥材質量的好壞，一方面是由本身所積累的產量所影響；另一方面取決于有效成分含量的高低。所以，中藥材的最佳采收期應在產量和有效成分含量相對較高的時期。一般來說，植物沒有生長成熟，產量較低，有效成分積累還沒達到頂峰，自然用藥效果也就不理想，若超過了中藥材的成熟期，造成人力、物力和財力浪費的同時，有效成分含量也會逐漸降低，直接影響藥物的臨床療效。因此，為了合理利用通關藤，尋找其最佳采收期就顯得至關重要。

本試驗研究不同生長期通關藤的莖粗和莖長，分析其產量的變化；測定不同生長期通關藤總皂苷的含量，通過產量和質量變化來確定通關藤的最佳采收時期，以期為通關藤的生產和臨床合理用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

DZF-6050B真空干燥箱（上海恒科學儀器有限公司）、家用小型粉碎機、梅特勒-托利多萬分之一電子天平、超聲波儀器（FS-550T，功率550 W，頻率50 Hz）、CARY 60 UV-Vis紫外分光光度計［安捷倫科技（中國）有限公司］、HH-S型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限公司）、電子數顯卡尺等。

1.2 材料與試劑

試驗所用對照品通關藤苷G［11，12］購于云南云科生物技術有限公司（編號PR1371，純度大于98%）；不同生長期的通關藤試驗材料由云南信通植物藥業有限公司通關藤規范化種植（GAP）良種繁育與示范基地提供，從基地取不同生長期（一年生、一年半生、兩年生、兩年半生、三年生、三年半生、四年生）通關藤的莖烘干粉碎備用。冰乙酸、香草醛、濃硫酸、97.5%乙醇、濃度5%香草醛-冰醋酸溶液均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 通關藤總皂苷含量測定

1）對照品溶液的制備。取通關藤苷G 1 mg，置于10 mL錐形瓶中，精密加入4.25 mL乙醇使其完全溶解，制成濃度為0.24 mg/mL的對照品溶液。

2）最佳供試品溶液提取方法的確定。采用4個因子，每個因子3個水平，共9個處理的正交試驗設計L（934）。以四年生通關藤為試驗材料，采用超聲波提取方法，提取時間為30、40、50 min 3個水平；提取溫度為40、50、60℃3個水平；提取溶劑乙醇體積分數為60%、70%、80%3個水平；料液比為1∶20、1∶30、1∶40（mg∶mL，下同）3個水平，探究超聲提取時間、提取溫度、乙醇體積分數、料液比對通關藤總皂苷提取的影響。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取通關藤粉末0.2 g，置于10 mL具塞試管中，精密加入60%乙醇4 mL，超聲提取時間50 min，提取溫度60℃，超聲結束后取出靜置15 min，取上清液備用。

1.3.3 空白對照溶液的制備 不加通關藤藥材，按照“1.3.2”的方法制備空白對照溶液。

1.3.4 樣品的測定 精密量取供試品上清液各0.5 mL，分別置于10 mL具塞試管中，于60℃水浴上揮干甲醇，加入香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和濃硫酸溶液0.6 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻，加入10 mL冰醋酸稀釋。以不加樣品溶液為空白。采用紫外-可見分光光度法在462 nm處測定吸光度，同法測定對照樣品的吸光度，計算含量即得。

1.3.5 標準曲線的制定 精密吸取制備的通關藤苷G對照品溶液（濃度0.24 mg/mL）0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mL置于10 mL具塞試管中，按照“1.3.4”的方法進行操作，在波長為462 nm處測定吸光度，以3次測定吸光度的平均值作為縱坐標，以對照品含量為橫坐標，繪制標準曲線（X為對照樣品含量，Y為吸光度）。回歸方程為Y=1.609 5X+0.024 9，r=0.999 4，呈良好的線性關系。

1.3.6 精密度試驗 按“1.3.2”的方法制備5份供試品溶液，并按照“1.3.4”的方法進行操作。結果顯示，RSD為1.37%，小于2.00%，精密度符合規定。

1.3.7 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，按“1.3.4”的方法進行操作，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，在462 nm下測定吸光度，RSD為1.69%，說明供試品溶液顯色后在3.0 h內待測定組分化學性質穩定。

1.3.8 回收率試驗 精密稱取0.1g已知含量的云南產通關藤藥材6份，分別加入對照樣品，按樣品含量的1/2加入，按“1.3.4”的方法制備供試品溶液，測定吸光度，并計算回收率。結果平均回收率為99.63%，RSD為1.46%。

1.3.9 樣品總皂苷含量的測定 精密稱取半年生、一年生、一年半生、兩年生、兩年半生、三年生、三年半生、四年生的8個生長期藥材各0.2 g，按“1.3.2”和“1.3.4”的方法進行操作，在462 nm處測定樣品吸光度，同法測定對照品吸光度。再利用回歸方程將吸光度代入，計算出通關藤總皂苷含量。

1.4 數據分析

采用SPSS19.0統計軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 提取條件對通關藤總皂苷提取率的影響

經LSR差異顯著性檢驗表明（表1），處理3通關藤總皂苷提取率最高，達到6.412 6%，與處理4、5差異達顯著水平，與處理1、2、6、8、9差異達極顯著水平。表明采用超聲波提取通關藤總皂苷溶液的最佳提取條件是提取溶劑乙醇體積分數為60%，料液比為1∶40，提取時間為50 min，提取溫度為60℃。

表1 提取條件對通關藤總皂苷提取率的影響（n=9）

2.2 通關藤總皂苷含量的測定

由表2可以看出，兩年生通關藤總皂苷含量為7.400 2%，與其他生長期總皂苷含量存在極顯著差異：兩年半生通關藤總皂苷含量為7.160 2%，與三年半生、四年生通關藤總皂苷含量也存在極顯著差異，最低的為半年生通關藤莖中總皂苷含量。通關藤總皂苷含量在兩年生至兩年半生時期相對較高、較穩定，之后緩慢下降。不同生長期通關藤總皂苷含量大小順序為兩年生＞兩年半生＞三年生＞三年半生＞四年生＞一年半生＞一年生＞半年生。

表2 通關藤總皂苷含量測定結果

2.3 不同生長期通關藤莖長和莖粗的測定

通關藤藥用部分是藤莖，呈扁柱圓形，略扭曲。莖類藥材的產量主要取決于莖粗和莖長，莖越長越粗，莖的質量就越大，產量就越高，因此莖類藥材產量與其莖長和莖粗呈正相關。測定材料通關藤種植時間在2016年5月，種植土地呈48°，向陽坡。種植行間距為2.0 m×0.5 m，田間水肥管理相同。以8個不同生長期通關藤作為調查對象，田間試驗抽樣采用五點式抽樣法，對抽中的植株進行掛牌，每年的11月和5月分別測定2次，測量莖長和莖粗。

結果（表3）表明，通關藤的莖長生長到三年時較之前的莖長差異達極顯著水平，之后增長緩慢。通關藤的莖粗生長到三年半以后較之前的莖粗差異達極顯著水平，以后也是緩慢增粗。因此，從通關藤的莖長和莖粗來看，到三年時進行采收，產量最大。

表3 不同生長期通關藤的莖長和莖粗

3 小結與討論

3.1 通關藤總皂苷含量測定

以正交試驗設計，采用超聲波法提取通關藤總皂苷，試驗數據通過統計分析，確定最佳的提取條件。當乙醇體積分數相對較低（60%）時，只要相對增加提取的溫度（60℃）和時間（50 min），就能增加總皂苷的提取率（6.412 6%）；或者適當增加乙醇的體積分數（80%），即使降低提取溫度（40℃），也可以保持較高的提取率（6.266 2%），能在較短時間和較低溫度下提取率比傳統的回流提取工藝明顯提高［13］。分析其原因，可能是因為超聲波能促使植物細胞組織產生破壁或變形，使中藥材有效成分充分溶解出來。

中藥材的種類繁多，用藥部位也有所不同，對應的最佳采收時間也不同。采收的時間是否恰當，會直接影響其臨床療效。最佳的采收時間是針對藥材的質量和產量而言的。中藥材質量的好壞，一方面是由本身所積累的產量所決定；另一方面取決于有效成分含量的高低。所以，中藥材的最佳采收期應在產量和有效期含量相對較高的時期。總皂苷屬于次生代謝產物，植物需要生長一定的時間進行積累［14］，試驗結果顯示通關藤總皂苷在兩年生時含量達到最高，之后緩慢下降。

試驗結果表明，8個不同生長期通關藤總皂苷含量隨著植株不斷的生長，呈先增后減的趨勢，存在極顯著差異。通關藤整個生長期中總皂苷含量在兩年以前含量增加很快，從半年生總皂苷含量的3.268 9%到兩年生達到最高，含量為7.400 2%，在兩年生到兩年半生（總皂苷含量為7.160 2%）之間維持一個較高的水平，之后逐漸緩慢下降。

3.2 通關藤的產量

對于不同生長期通關藤的莖長和莖粗的測定，采取順序抽樣法中的五點式抽樣方法，此方法操作簡單，能使抽樣單位在試驗小區中均勻分布，樣本具有代表性，一般情況下這種抽樣方法存在的誤差較小。但若存在趨勢變異，可能出現偏差，而且難以無偏估計抽樣誤差。所以要在抽樣樣本個體性狀表現一致時，再采用順序抽樣法進行抽樣。

不同生長期通關藤的莖粗和莖長隨年份的增長而增加，通關藤藥用部分是藤莖，莖長和莖粗決定著產量的高低。通關藤的莖長從三年生、三年半生、四年生都與之前存在極顯著差異，以后緩慢生長；通關藤的莖粗生長到三年半就達到極顯著差異，以后也是緩慢增粗。因此，從通關藤的莖長和莖粗來看，通關藤生長到三年時繼續種植，雖然生物產量會有所增大，但增加不顯著，所以通關藤生長到三年時進行采收，可以節約大量的人力、物力和財力。

3.3 小結

根據本試驗結果分析得出，通關藤的產量到三年生時增長明顯，產量也相對較高。而通關藤總皂苷含量最高的為兩年生，之后逐漸緩慢下降。所以考慮到兼顧通關藤的產量與總皂苷含量都達到相對較高水平，確定最佳采收時間為兩年生至三年生的通關藤莖，該結論可為通關藤臨床用藥提供理論依據。