基于網絡藥理學的中藥復方知柏地黃丸治療代謝綜合征的機制研究

李嘉鑫 李慧 劉思佳 孟憲悅 李艷春 楊宇峰 石巖 張丹

摘要 目的：應用網絡藥理學的研究方法挖掘中藥復方知柏地黃丸治療代謝綜合征的物質基礎及其作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫檢索中藥復方知柏地黃丸中八味中藥的主要活性成分，并進行靶點預測。通過OMIM、TTD、DisGeNET數據庫檢索代謝綜合征的相關靶點，將中藥靶點與疾病靶點取交集得到共同作用靶點。應用STRING平臺構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，通過Cytoscape軟件對其進行拓撲學分析篩選出核心靶點。最后，基于Metascape軟件并進行GO-BP生物功能富集和KEGG通路分析。結果：經數據庫分析中藥復方知柏地黃丸中含有活性化合物74個，作用靶點906個，其中290個為與代謝綜合征共有靶點;通過對共有靶點的拓撲分析，篩選出核心靶點78個，GO-BP生物功能富集以及KEGG通路分析發現，其可通過循環系統、G蛋白偶聯受體信號通路、脂多糖調節、調控血壓、脂質代謝調節等多種生物學功能以及血管內皮生長因子信號通路、鈣信號通路、ErbB信號通路等多條代謝通路發揮其治療作用。結論：中藥復方知柏地黃丸可通過過氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）、轉錄激活因子-3（STAT3）、磷脂酰肌醇激酶（PIK3）等靶點經過循環系統、G蛋白偶聯受體信號通路、與環狀核苷酸第二信使偶聯以及VEGF信號通路、鈣信號通路、ErbB信號通路等代謝通路發揮治療代謝綜合征的作用，為其臨床和基礎研究提供新的科學依據。

關鍵詞 中藥復方;知柏地黃丸;網絡藥理學;靶點預測

Study on the Mechanism of Chinese Medicine Zhibai Dihuang Pill in the Treatment of Metabolic Syndrome Based on Network Pharmacology

LI Jiaxin，LI Hui，LIU Sijia，MENG Xianyue，LI Yanchun，YANG Yufeng，SHI Yan，ZHANG Dan

（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

Abstract Objective：To explore the material basis and mechanism of Chinese compound Zhibai Dihuang Pill in the treatment of metabolic syndrome by the application of network pharmacology research methods.Methods：Through the Chinese Medicine System Pharmacology Technology Platform （TCMSP） database，the main active components of traditional Chinese medicine compound Rhizoma Anemarrhenae，Cortex Phellodendri，Radix Rehmanniae Preparata，Fructus Corni，Rhizoma Dioscoreae，Cortex Moutan Radicis，Rhizoma Alismatis were retrieved and made for target prediction.The OMIM，TTD，and DisGeNET databases were used to retrieve the relevant disease targets of the metabolic syndrome，and the eight-flavored Chinese medicine target was intersected with the disease target to screen for a common target.The STRING platform was used to construct a protein-protein interaction（PPI） network model，and the network was topologically analyzed by using Cytoscape software to obtain the core target.GO-BP biofunctional enrichment analysis and KEGG pathway analysis were performed on the core targets by Metascape software.Results：By database analysis，it was inferred that the database of Chinese medicine compound Zhibai Dihuang Pill contained 74 active compounds，906 target sites，and 290 targets shared with metabolic syndrome.Through the topological analysis of common targets，the core of Chinese medicine compound Zhibai Dihuang Pill was screened for 78 target.From GO-BP biological function enrichment and KEGG pathway analysis，it was found that through the circulatory system，G protein coupled receptor signaling pathway，lipopolysaccharide regulation，regulation of blood pressure，lipid metabolism regulation and other biological functions，and a variety of metabolic pathways such as calcium signaling pathway，VEGF signaling pathway and ErbB signaling pathway they played a therapeutic role.Conclusion：This study explored the material basis and mechanism of Chinese medicine compound Zhibai Dihuang Pill in the treatment of metabolic syndrome，and provided a new scientific basis for its clinical and basic research.

Keywords Traditional medicine compound; Zhibai Dihuang Pill; Network pharmacology; Target prediction

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.005

代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）這一疾病概念最早由Reaven提出，指人體的蛋白質、脂肪、碳水化合物等物質發生代謝紊亂的一組復雜綜合征，同時也是導致糖尿病和心腦血管疾病的重要危險因素。世界衛生組織于1998將其定義為機體出現胰島素抵抗并伴有肥胖、高脂血癥、高血壓、微量蛋白尿等任意2個及以上危險因素[1]。因此MS又稱為X綜合征、高三酰甘油血癥等。隨著經濟的不斷發展和現代人生活水平的提高，代謝綜合征的發病率也不斷增加，且越來越受到醫生的重視。2005年國際糖尿病聯盟（IDF）估計全球約有1/4人口患有代謝綜合征[2]。根據一項在我國的調查數據顯示，60歲以上的人群中58.1%患有MS，且北方明顯高于南方[3]。中醫認為先天稟賦不足、過食肥甘厚味、勞逸過度、情志失調等皆可導致本病的發生，其總病機為本虛標實、虛實夾雜。中醫治療MS則根據其不同的證候表現進行辨證論治，大多采用攻補兼施的方法。中藥復方知柏地黃丸由知母、黃柏、熟地黃等八味中藥組成，在臨床上主要用于治療陰虛火旺之證。《醫方考》卷5原名六味地黃丸加黃柏知母方[4]，原治腎勞，背難俯仰，小便不利，有余瀝，囊濕生瘡，小腹里急，便赤黃者。

中藥復方治療疾病具有多成分、多靶點、多環節的協調作用，方劑配伍更是遵循“君、臣、佐、使”的配伍原則。網絡藥理學則是通過多學科的交叉應用以及整體生物網絡的分析與再整合，從預測和辨識中藥復方的作用靶點、闡明作用機制、科學解釋組方規律、發現新的適應證及與組學技術結合應用等多個方面，構建多層次的網絡模型，從整體角度對中藥復方進行研究[5-6]。其運用先進的科學技術及國際通用的科學語言，對抽象的中醫藥理論加以詮釋，闡明中藥復方的有效性和科學性，使之與現代醫學相接軌，符合中醫藥現代化的發展需要。我們應用網絡藥理學技術探索知柏地黃丸治療MS的作用靶點及其機制，為其今后的臨床和基礎研究提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 中藥成分及靶點的獲取

分別以中藥復方知柏地黃丸中8味中藥作為檢索詞在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）進行檢索[7]，并以口服吸收率（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18和半衰期（HL）≥4 h作為篩選條件，獲得知柏地黃丸的主要成分。然后通過PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到Smiles格式，最后利用Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstarget-prediction.ch/），得到中藥成分的作用靶點。并利用Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）對其進行標準化處理，從而挖掘黃柏、知母、熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉8味中藥的成分和作用靶點。

1.2 疾病靶點的篩選

在OMIM（http：//www.omim.org/）、TTD（http：//www.genecards.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）數據庫中，分別搜索疾病關鍵詞為代謝綜合征（Metabolic Syndrome），合并檢索結果并去除重復值，篩選出MS的疾病靶點。

1.3 中藥-疾病靶點網絡構建及核心靶點的篩選

應用Venny（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將中藥復方知柏地黃丸中八味中藥的作用靶點與MS的疾病靶點取交集，篩選出中藥-疾病共同含有的靶點，繪制韋恩圖。在String平臺（https：//string-db.org/）構建共有靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，其中種類為“Homo sapiens”，“highest confidence>0.9”，獲得PPI網絡圖同時保存csv.格式文件。并應用Cytoscape軟件中“Network Analyzer”模塊對該文件中node1、node2和Combined score信息進行可視化分析，篩選“節點度值分布（Degree）和介數中心性（Betweenness Centrality）”同時在中位數以上的作為“核心靶點”。Degree和Betweenness Centrality的值與節點重要性成正比。

1.4 生物功能注釋及通路分析

為挖掘其在治療MS方面的作用機制，利用Metascape[8]（http：//metascape.org/）對上述篩選出的靶點進行GO-BP富集分析和KEGG通路分析。最后繪制核心靶點-KEGG信號通路-GO-BP生物功能相互作用網絡圖。

2 結果

2.1 中藥復方主要成分及靶點的篩選

通過在TCMSP中檢索中藥的成分和對其的進一步篩選，分別得到主要成分黃柏27個、山茱萸16個、山藥16個、茯苓14個、知母14個、澤瀉10個、牡丹皮9個、熟地黃2個，刪去重復值共得到主要化學成分74個。通過Swiss Target Prediction數據庫，得到化學成分的作用靶點山茱萸605個、黃柏503個、知母381個、澤瀉321個、茯苓250個、山藥220個、牡丹皮185個、熟地黃47個，去除重復靶點共得到905個作用靶點。

2.2 中藥復方與疾病共同靶點的篩選

基于OMIM數據庫、TTD數據庫與DisGeNET數據庫對MS的疾病靶點進行檢索、篩選，共獲得靶點883個。將中藥復方知柏地黃丸靶點與MS疾病靶點輸入Venny 2.1軟件繪制韋恩圖。見圖1。二者取交集后獲得MS與中藥復方知柏地黃丸共有靶點290個。

2.3 PPI網絡與核心靶點分析

利用String對上述得到的中藥復方知柏地黃丸與MS共同作用靶點繪制PPI網絡圖。見圖2。應用Cytoscape軟件對網絡中所有點的進行分析和篩選，共得到中藥復方知柏地黃丸78個核心靶點。即：過氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）、磷脂酰肌醇激酶（PIK3）、轉錄激活因子-3（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子A（VEG-FA）、維A酸類受體α（RXRA）、尿激酶型纖溶酶原激活蛋白（PLAU）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、纖溶酶原（PLG）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、白細胞介素-2（IL-2）、絲氨酸/蘇氨酸激酶2（AKT2）、激酶插入區域受體（KDR）等等。

2.4 核心靶點生物功能富集分析

GO-BP生物學功能富集分析結果顯示中藥復方知柏地黃丸主要通過循環系統（Circulatory System Process）、G蛋白偶聯受體信號通路（G Protein-coupled Receptor Signa-ling Pathway）、與環狀核苷酸第二信使偶聯（Coupled to Cyclic Nucleotide Second Messenger）、化學突觸傳遞（Chemical Synaptic Transmission）、脂多糖反應（Response to Lipopolysaccharide）、水解酶活性調節（Positive Regulation of Hydrolase Activity）、離子傳輸調節（Regulation of Ion Transport）、體液水平的調節（Regulation of Body Fluid Levels）、血壓的調控（Regulation of Blood Pressure）、肽絲氨酸磷酸化（Peptidyl-serine Phosphorylation）、細胞對脂質的反應（Cellular Response to Lipid）、細胞對激素刺激的反應（Cellular Response to Hormone Stimulus）、機體活動的積極調節（Positive Regulation of Locomotion）、磷脂酰肌醇信號傳導（Phosphatidylinositol-mediated Signaling）、趨化性調節（Chemotaxis）、激酶活性的正調控（Positive Regulation of Kinase Activity）、二價無機陽離子穩態（Divalent Inorganic Cation Homeostasis）等生物學功能發揮其治療MS的作用。見圖3。

2.5 核心靶點KEGG通路分析及核心靶點-生物功能-信號通路網絡構建

KEGG通路富集分析結果顯示中藥復方知柏地黃丸可通過神經活性配體-受體相互作用（Neuroactive Ligand-receptor Interaction）、鈣信號通路（Calcium Signaling Pathway）、VEGF信號通路（VEGF Signaling Pathway）、ErbB信號通路（ErbB Signaling Pathway）、FcεRI信號通路（Fc Epsilon RI Signaling Pathway）、細胞因子與細胞因子受體的相互作用（Cytokine-Cytokine Receptor Interaction）、T細胞受體信號通路（T Cell Receptor Signaling Pathway）、補體和凝血級聯（Complement and Coagulation Cascades）等49條KEGG通路發揮治療MS的作用。見圖4。最后基于Cytoscape軟件構建核心靶點-生物功能-信號通路網絡。見圖5。

3 討論

MS是一組以肥胖、高血壓、糖尿病或糖調節受損以及血脂異常等疾病的臨床綜合征，嚴重影響機體健康，甚至可導致各種心腦血管疾病的發生。目前國際上MS的診斷標準較多，常用的有3種：1999年世界衛生組織診斷標準[1]、2001年美國國家膽固醇教育綱要成人教育組第3次報告（NCEP-ATPⅢ）診斷標準[9]以及2005年國際糖尿病聯盟診斷標準[10]。在2017年中華中醫藥學會發布的《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》中亦對我國MS的診斷標準做出了規范[11]。可見，MS越來越受到臨床醫生的重視。

中醫古籍中并無MS的病名，依據其發病和臨床表現，可參考“肥胖”“腹滿”“胸痹”“眩暈”“痰飲”“消渴”“頭痛”等范疇進行論治。中醫藥在治療MS方面具有獨特優勢。知柏地黃丸出自《景岳全書》，為滋陰清熱降火的代表方劑，是在六味地黃丸的基礎上加知母、黃柏兩味藥而成。方中知母、黃柏清熱滋陰潤燥以治燥熱之標，熟地黃用之可大滋腎陰，壯水之主;山萸肉色赤入心，味酸入肝，能夠補肝益腎，從左以納于腎。山藥色白入肺，味甘入脾，能夠祛寒熱、補虛健中，從右以納于腎。三藥合用，既能五臟兼入，不致偏倚，又能將諸臟之氣，盡行納入腎臟，以為統攝臟陰之主。牡丹皮可清血分中熱，具有涼血、解熱、化瘀、和血之功效;澤瀉味甘、寒，可化濁降脂、滲濕利水;茯苓可清氣分之熱，歸心、肺、脾、腎經，具有利水滲濕、健脾寧心之功效;以上藥物合用，共奏滋陰清熱之功效。龔敏等[12]通過臨床研究發現知柏地黃丸可有效降低葡萄糖耐量受損患者（IGT）的空腹血糖及餐后2 h血糖，減少腰圍，降低血脂。

研究結果顯示中藥復方知柏地黃丸中含有化學成分74個，作用靶點906個，290個與MS共同靶點。通過對其進行PPI網絡分析，得到78個核心靶點。研究結果顯示中藥復方知柏地黃丸可通過組成藥物中的多種活性成分作用于STAT3、PIK3、PPAR、MAPK、EGFR、VEGFA等靶點，從而經過循環系統、G蛋白偶聯受體信號通路、與環狀核苷酸第二信使偶聯、脂多糖調節、水解酶活性的調節、離子傳輸調節、體液水平的調節、調控血壓、脂質代謝調節、機體活動調節等生物學功能以及VEGF信號通路、神經活性配體-受體相互作用、FcεRI信號通路、鈣信號通路、ErbB信號通路等代謝通路發揮其治療作用，同時也說明了其對MS潛在的調控機制。STAT3可以通過JAK2/STAT3信號通路，激活VEGF，從而誘導內皮細胞增殖[13-14]。PIK3R是PI3K的調節亞基，是PI3K/Akt信號傳導通路的重要組成部分，Yang等[15]研究顯示PIK3R3可以通過PPAR來調節肝細胞脂肪酸的β-氧化。PPAR是一種代謝性核受體，作為脂肪細胞分化和糖脂代謝過程中的重要調節因子，在脂肪細胞基因表達和胰島素信號傳導過程中均起到主要調節作用，其可通過參與機體的脂質代謝，進而調控脂肪酸吸收和脂肪的形成，其基因突變可引起IR[16]。MAPK是一類廣泛存在于哺乳動物體內的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可以通過調控蛋白p38 MAPK、JNK、ERK等參與細胞生長、炎癥反應、氧化應激和細胞調亡等過程[17]。EGFR參與調控細胞代謝、增殖、遷移和分化，既往研究表明抑制EGFR信號通路的傳導，可明顯減少活性氧（ROS）的生成，從而抑制內質網應激反應[18-19]。VEGFA可維持血管正常狀態及完整性、促進血管內皮細胞的增殖、增加血管的通透性、提高機體對損傷的修復[20-21]。李亞璞等[22]通過建立MS幼鼠模型及應用免疫組織化學觀察其血管組織的病變程度發現，VEFG的含量與其血管的病變程度成正相關，說明VEFG可導致心血管疾病的發生，進而使MS病情加重。通過兩方的比較分析，知柏地黃丸還可通過肽基絲氨酸磷酸化、細胞對激素刺激的反應、磷脂酰肌醇介導的信號傳導、趨化性調節、激酶活性的正調控、二價無機陽離子穩態調節等生物學過程以及細胞因子與細胞因子受體的相互作用、補體和凝血級聯等代謝通路從而進一步發揮其治療MS的作用。毛連根等[23]通過應用知柏地黃丸治療陰虛“上火”證大鼠，發現其可通過對大鼠血清凝溶膠蛋白（Gsn）、胸腺素β4（T-β4）、纖維蛋白原α鏈（Fga）、纖溶酶原（Plg）水平的調節，從而清除損傷組織，釋放肌動蛋白和細菌脂多糖，抑制細胞凋亡，進一步說明知柏地黃丸具有調節炎癥介質，改變炎癥反應局部的血液流變學，促進炎癥反應損傷愈合的作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學技術從成分、靶點、生物功能、代謝通路等多角度探索中藥復方知柏地黃丸治療MS的作用機制，為今后研究其藥理機制提供參考，但后期仍需要實驗對其進一步驗證。

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（2019-10-25收稿 責任編輯：楊覺雄）