基于加權基因共表達網絡分析槲皮素抗胃癌的基因模塊和分子標志物研究

張林 歐祥琴 張濤 鐘凱 吳學會 李睿思 李青璇 梁峰 張軒

摘要 目的：根據加權基因共表達網絡（WGCNA）探索槲皮素抗胃癌的潛在生物靶標。方法：利用TCGA數據庫下載胃癌相關轉錄組和臨床數據，分析胃癌轉錄組表達的差異基因，利用網絡藥理學找到槲皮素的作用靶點，找出槲皮素與胃癌的hub基因。通過KEGG通路，GO基因富集分析尋找hub基因的靶點及通路，探索hub基因的在胃癌臨床數據中的生存分析和性狀表達的差異。結果：1）共發現槲皮素142個靶點，共139個蛋白質-蛋白質相互作用關系;2）KEGG通路富集分析發現槲皮素抗胃癌的作用通路可能與細胞衰老、MicroRNAs的表達、P53信號通路有關;3）生存分析發現纖溶酶原激活物抑制劑-1（SERPINE1）、微囊蛋白-1（Caveolin-1）、雄性激素受體（AR）、轉錄因子E2F2（E2F2）、前列腺素E2受體EP3亞型（PTGER3）在胃癌中的表達差異會影響患者的預后（P<0.05）;4）在胃癌的TNM分期中，AR與PTGER3的表達差異與胃癌的分期相關（P<0.05）;5）GEPIA數據庫分析，AR與PTGER3在胃癌組織中的表達存在一定的相關性（P<0.05）。結論：槲皮素抗胃癌機制可能和細胞凋亡、MicroRNAs表達和P53信號通路有關，通過多靶點作用于SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3，發揮抑制癌細胞，改善患者預后的作用。

關鍵詞 加權基因共表達網絡;胃癌;hub基因;槲皮素

Study on the Mechanism of Quercetin Anti-gastric Cancer Gene Module and Molecular Marker Based on Weighted Gene Co-expression Network

ZHANG Lin1，OU Xiangqin2，ZHANG Tao3，ZHONG Kai3，WU Xuehui3，LI Ruisi3，LI Qingxuan3，LIANG Feng3，ZHANG Xuan4

（1 First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China; 3 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301608，China; 4 School of Chinese Medicine，Hong Kong Baptist University，Hong Kong 99077，China）

Abstract Objective：To explore the potential biological target of quercetin against gastric cancer based on the weighted gene co-expression network（WGCNA）.Methods：TCGA database was used to download gastric cancer related transcriptome and clinical data to analyze the differential genes expressed in gastric cancer transcriptome.Meanwhile，network pharmacological means was used to find the drug action targets of quercetin and find the hub genes of quercetin in gastric cancer.The targets and pathways of hub genes were searched through KEGG pathway and GO gene enrichment analysis which were aimed to explore the survival analysis and trait expression differences of hub genes in clinical data of gastric cancer.Results：1）A total of 142 targets and 139 protein interactions were found for quercetin.2）Enrichment analysis of KEGG pathway found that the anti-gastric cancer pathways of quercetin may be related to cell senescence，the expression of MicroRNAs，and the P53 signaling pathway.3）Survival analysis found that the expression differences of plasminogen activator inhibitor-1（SERPINE1），microencapsulated protein-1（Caveolin-1），androgen receptor（AR），transcription factor E2F2（E2F2），and prostagtin E2 receptor EP3 subtype（PTGER3）in gastric cancer affected the prognosis of patients（P<0.05）.4）In TNM staging of gastric cancer，the difference in expression of AR and PTGER3 was correlated with the staging of gastric cancer（P<0.05）.5）GEPIA database analysis showed that there was a certain correlation between AR and PTGER3 expression in gastric cancer tissues（P<0.05）.Conclusion：The anti-gastric cancer mechanism of quercetin may be related to apoptosis，MicroRNAs expression and P53 signaling pathway.It acts on SERPINE1，CAV1，AR，E2F2，and PTGER3 through multiple targets to inhibit cancer cells and improve the prognosis of patients.

Keywords Weighted gene co-expression network; Gastric cancer; Hub genes; Quercetin

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.004

胃癌（Gastric Carcinoma，GC）是指源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是全球發病率最高的5種腫瘤之一，在與癌癥有關的死亡人數中排名第3位[1]。GC為全球醫療體系帶來巨大的醫療和經濟問題[2]。由于診斷和治療方法的改進，早期GC患者生存率有所提高，但晚期GC的療效不理想。而且由于GC的診斷往往被延遲，臨床處理效率低，因此大多數GC病例診斷的時候已經表現為局部擴散或轉移[3]。根據中華人民共和國國家衛生健康委員會發布的《2018胃癌診療規范》[4]，GC的治療原則是多學科綜合治療，使用手術、化療、放療和生物靶向治療等手段，此規范同時指出中醫藥治療GC有助于改善手術并發癥，緩解放化療的不良反應，肯定了中醫藥治療GC的療效。

槲皮素是多種中藥的有效成分，研究發現，槲皮素對GC[5]、乳腺癌[6-7]、結腸癌[8]、子宮內膜癌[9]等具有抗腫瘤療效。槲皮素[10]能抑制GC細胞的增殖和侵襲作用，在聯合槲皮素化療的研究中，可以通過抑制c-Jun的表達增強5-氟尿嘧啶對GC細胞凋亡[11]，聯合伊馬替尼可以誘導GC細胞通過Caspase-9和Caspase-3凋亡[12]。

加權基因共表達網絡分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）基于變量相關性，挖掘生物體系內基因互作網絡體系，利用轉錄組和臨床數據尋找具有協同表達特性的基因模塊，進一步探索基因網絡與患者臨床性狀之間的關系。本研究的目的是根據癌癥基因組數據庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中GC的轉錄組與臨床數據，利用WGCNA挖掘GC相關的基因網絡，探索GC中特異表達的關鍵基因，進一步分析槲皮素抗GC的hub基因與靶點，為臨床基礎研究實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 槲皮素靶點數據庫的建立 通過檢索中醫藥系統藥理學（TCMSP）數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以化學成分“quercetin”作為篩選項，篩選目前已知槲皮素的全部作用靶點，再根據UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）獲取對應靶點的簡寫，將靶點上傳至String數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），獲取蛋白質的相互作用信息，并導入Cytoscape3.7.1，分析蛋白的相互作用關系。

1.2 TCGA數據的獲取 本研究下載TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數據庫共407個GC相關的轉錄組數據，其中正常樣本32個，腫瘤樣本375個，下載455個與GC相關的臨床數據，包括年齡，性別，GC TNM分期，生存時間等數據。

1.3 篩選GC差異基因（DEGs） 利用R4.0.0語言，先對數據進行注釋和整理，使用DESeq2數據包進行差異表達基因篩選，使用Limma數據包，以LogFC>1，P<0.05作為篩選條件，篩選DEGs，再使用ggplot2數據包分別得到差異基因的火山圖和聚類熱圖。

1.4 特異基因網絡模塊的分析 利用R4.0.0語言的WGCNA數據包，構建GC加權共表達網絡[13]。先構建接近真實生物網絡狀態的無尺度網絡，使用函數Pick Soft Threshold選擇合適的閾值參數β。然后根據確定的閾值，以基因間皮爾遜相關系數構建鄰接矩陣，轉換拓撲矩陣，接著進行層次聚類，再用分支切割法（Branch Cutting Method）來識別構建模塊。本研究中以最小尺寸50為分割的基因樹狀圖，建立平均連鎖層次聚類，將相似基因劃分為一個模塊，根據正常組織和GC組織中的基因表達差異，篩選最優模塊。

1.5 蛋白質互作網絡（PPI）的構建 hub基因是槲皮素靶點與差異基因的靶點取交集，上傳至String數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），獲取蛋白的互作用信息，并導入Cytoscape3.7.1，找出蛋白之間的互作用關系。

1.6 富集分析與生存分析 根據GC WGCNA的最優模塊和差異基因，使用R4.0.0語言做KEGG和GO富集分析，并將hub基因根據臨床數據進行比較，挖掘槲皮素抗GC的關鍵基因。

1.7 GEPIA驗證 將和臨床資料差異分析后具有統計學意義的關鍵基因帶入GEPIA數據庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn/△index），查詢關鍵基因的表達與GC的關系，以及基因之間在GC組織的表達是否具有相關性，探索槲皮素抗GC機制。

2 結果

2.1 槲皮素靶點 通過中藥網絡藥理學平臺可知，槲皮素共有142個靶點，導入String數據庫，共有139個互作用蛋白，根據度值篩選出前15互作用蛋白。見表1。

2.2 差異基因 根據TCGA數據庫獲得的407個臨床樣本，共獲取2 785個差異表達基因，包括1 570個下調基因，1 125個上調基因，火山圖與差異性排名前40基因的聚類熱圖。見圖1。

2.3 WGCNA模塊分析 根據R4.0.0語言，篩選出4為軟閾值，根據軟閾值做分層聚類樹，共得到

14個模塊，以此所獲取的分層聚類樹與相關模塊的表達差異如圖2所示，可知在藍色模塊與GC的相關性最高（R=0.55，P=5e-33）見圖2（B），正常組織與腫瘤組織的表達關聯最大，選擇此模塊中的基因與2.2中的差異基因取交集，共得到463個基因。

2.4 GO與KEGG的富集分析 將2.3所獲取的463個基因通過R4.0.0進行基因ID轉換，通過clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot數據包，對交集基因做GO與KEGG富集分析。見圖3。GO富集分析顯示GC與DNA和細胞的增殖分化有關，KEGG富集分析與細胞衰老，MicroRNAs的表達、P53信號通路有關，相關的基因富集信息見表2。

2.5 槲皮素hub基因的生存分析 將槲皮素的靶點與差異基因做交集，獲得42個槲皮素抗GC的hub基因，導入String數據庫，使用Cytoscape3.7.1繪制蛋白質-蛋白質相互作用網絡，如圖4，根據TCGA下載的GC相關的臨床數據，先刪除正常樣本，再觀察hub基因在臨床生存與腫瘤分期的表達差異是否有統計學意義。槲皮素延緩GC患者的生存期，可能和5個基因有關，分別是纖溶酶原激活物抑制劑-1（SERPINE1）、微囊蛋白-1（CAV1）、雄激素受體（AR）、轉錄因子E2F2、前列腺素E2受體EP3亞型（PTGER3），且P<0.05。見圖5。

將所挖掘出的5個hub基因對腫瘤分期差異進行分析，分析的臨床數據所使用的是TNM分期[4]。發現在AR的表達中，Ⅰ期對Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅴ期表達差異有統計學意義（P<0.05）;PTGER3的表達中，Ⅰ期對Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅴ期差異有統計學意義（P<0.05），其他基因在GC各期的表達差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。

2.6 GEPIA驗證 將2.5所得到的SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3帶入GEPIA數據庫進行驗證，組織種類選擇GC（STAD），通過無病生存期（Disease Free Survival，DFS）分析，結果AR、PTGER3和SERPINE1在DFS驗證中，高表達與低表達對DFS差異有統計學意義（P<0.05）。見圖7。由2.5中可知AR與PTGER3的表達對GC的分期差異有統計學意義，選擇這2個基因做關聯，發現（R=0.54，P<0.05），說明AR與PTGER3的基因表達在GC組織中呈現正相關，差異有統計學意義。

3 討論

根據全國腫瘤登記中心2015年發布的報告，我國GC發病率高達67.9萬，僅次于肺癌（73.3萬）[14]。在GC的病因中，幽門螺旋桿菌是GC發生的Ⅰ類因子，基因多態性也是GC發生的原因，GC的發生發展與CDH1，RUNX，IL-6，IL-10，IL-1β，TNF等有關[15]。本研究槲皮素的互作蛋白中，IL-6，TNF，RUNX，IL-1β均是槲皮素的作用靶點，槲皮素的抗GC機制也許和這些靶點有關。

本研究對槲皮素抗GC機制進行分析，在GO，KEGG富集分析中，發現槲皮素的抗GC機制可能與細胞衰老、MicroRNAs的表達、P53信號通路有關。在MicroRNAs的相關研究中，槲皮素通過促進miRNA-206/connexin 43途徑刺激骨髓基質細胞的成骨分化，調控細胞的生長周期[16]，在氧化應激的情況下，槲皮素和兒茶素的共同作用可以通過抑制let-7a-5p和miR-25-3p調節細胞增殖[17]。細胞凋亡是細胞程序性衰老和死亡的組成，對調控腫瘤細胞的增殖具有重要作用，在細胞凋亡的相關研究中，槲皮素能通過調節活性氧誘導的內皮細胞凋亡來降低動脈粥樣硬化[18]，誘導結腸癌細胞的凋亡[19]。槲皮素有良好的抗腫瘤機制，含有槲皮素的消癌解毒方具有抗結腸癌的療效[20]，其作用機制可能與P53信號通路有關[21]。槲皮素聯合喜樹堿能促前列腺癌PC-3細胞的凋亡[22]。在P53信號通路中，槲皮素能通過上調P53來增強曲古抑菌素A的抗腫瘤活性[23]，在HPV陽性的宮頸癌中，通過誘導P53活化調節癌細胞的凋亡[24]，通過既往文獻分析，槲皮素的抗GC機制可能與細胞凋亡、MicroRNAs的表達、P53信號通路有關。

在槲皮素與GC相關基因的生存分析中，SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3在人體表達的高低對患者的預后有影響（P<0.05）。在肥胖患者中，槲皮素的保護作用不僅是由于清除自由基的活性，而且還直接影響線粒體過程，并與SERPINE1有關[25]，在一項GC的數據挖掘中，發現SERPINE1的表達與年齡，T分期相關，能影響GC患者的預后[26]，SERPINE1表達情況是影響GC預后的獨立危險因素。槲皮素的抗GC機制可能與SERPINE1有關。CAV1的表達與GC的分期和嚴重程度呈負相關[27]，槲皮素可抑制GC SGC-7901細胞CAV1的表達，GC細胞的凋亡可能與CAV1表達有關[28]。槲皮素可以通過雄激素受體和PI3K/Akt信號通路逆轉前列腺癌中的多西他賽耐藥性[29-30]。NRAS和E2F2能增強GC細胞對基于順鉑化療的敏感性，E2F2的表達水平與抑癌基因mi R-31的表達水平呈顯著負相關[31]，抑癌基因miR-365可以通過E2F2抑制GC細胞增殖[32]。本研究無病生存率的分析中發現，AR、PTGER3和SERPINE1的高表達會影響患者的無病生存率。

綜上所述，本研究根據WGCNA網絡，對槲皮素治療GC的基因模塊進行篩選，發現槲皮素抗GC的機制可能與細胞凋亡、MicorRNAs的表達和P53信號通路相關，對hub基因進行臨床數據的生存分析，發現SERPINE1、CAV1、AR、E2F2、PTGER3可能是槲皮素抗GC，改善患者預后的靶點，AR與PTGER3可能是槲皮素抗GC，影響GC分期的靶點，且AR與PTGER3在GC中的表達存在一定的相關性。以上研究結果具有一定意義，有助于以后槲皮素抗GC的臨床研究和靶點治療。

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（2020-09-11收稿 責任編輯：王明）