館藏書畫與絲織文物上霉菌的分離與分子鑒定研究

閆麗　洪巍　呂曉芳

摘 要：書畫與絲織文物在埋藏或館藏過程中由于受到環境因素等影響易被霉菌污染。霉菌產生的色素和生物酶等代謝產物會造成文物污損，會使材質脆化、褪色甚至腐爛等，從而影響文物的保存及文物價值的延續。書畫和絲織文物污染霉菌的分離和鑒定有助于確定文物霉菌防治的重點，有利于減輕霉菌對文物的危害，能更好地延續其價值。在本研究中采用形態學觀察及分子生物學技術對北京館藏書畫與絲織文物上分離出的10株霉菌進行菌落形態學和顯微觀察，并研究霉菌的分泌色素。通過ITS序列分析鑒定10株霉菌屬于曲霉和青霉屬，并進行系統進化樹分析。對分離霉菌的形態學和分子鑒定進行研究，為未來開發生物防霉制劑和防霉技術提供了一些新思路。

關鍵詞：文物;霉菌;分離;分子鑒定

1 背景概述

書畫和絲織文物為有機質文物，其構成材料主要是紙和絹。其中含有的有機成分（纖維素、半纖維素、木質素、淀粉和蛋白質）可以成為微生物生長的培養基，容易受到霉菌的污染。①其中紙質文物主要成分為纖維素，更加容易受到霉菌的污染。霉菌對紙質文物的污損主要集中在以下幾個方面：①增加紙質文物的酸度，降低紙張的強度，破壞紙質文物的材料結構。②霉菌在紙質文物上代謝產生色素，形成霉斑，使紙質文物褪色或顏色發生變化，它不僅影響了紙質文物的審美價值，而且對文物的歷史價值產生了重要影響。③增加紙張濕度，造成粘連，從而導致紙張黏附。④分泌毒素，危害人體健康。②

近年來，通過分離和分子鑒定對不同省市博物館館藏文物污染霉菌進行了相關研究。國內不同省市書畫與絲織文物由于地理環境和保藏條件的不同，導致文物污染霉菌也存在差異。早期故宮博物院和中國國家博物館的研究較多。例如：馬淑琴等對35件故宮文物上的霉菌進行調查分析，發現主要霉菌為黑曲霉、綠色木霉、桔青霉和黑根霉等。③首都博物館閆麗等從中國古代書畫中分離獲得22株真菌，并利用真菌ITS區DNA序列進行進化分析，并通過形態分析以及菌絲的顯微鏡觀察驗證了實驗結果，確定了引起古代書畫文物污染的霉菌是由多種霉菌共同作用的結果，污染霉菌主要包括煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、青霉（Penicillium tenerum）和黑曲霉（Aspergillus niger）。④武望婷等從出土文物中抽取水樣和泥樣，通過菌落的微觀形態特征、培養特征觀察，使用DNA-ITS和β-tubulin生物學方法分離鑒定研究，確定實驗室文物樣品中主要霉菌屬于青霉屬。⑤

不同館藏的紙質或紡織文物所污染霉菌主要為絲狀真菌，由于受到不同埋藏或館藏環境條件的影響，存在差異。為進一步系統研究北京紙質或絲織文物的主要污染霉菌分類，本研究選取了59個文物樣品，來自北京三家文物保藏研究單位。對文物主要污染霉菌進行分離、理化分析和分子鑒定。本研究采用形態學觀察及分子生物學鑒定綜合方法，提高了文物樣本中污染霉菌鑒定分析的準確性，該研究為后期針對性地開發防霉制劑提供了理論依據。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 供試文物樣品

紙質和絲織文物樣品來源于中國國家博物館、首都博物館和北京服裝學院三家單位的紙質和絲織文物館藏樣品。以下列舉部分代表文物樣品的信息。

①古11：北魏（鮮卑），原所有者不詳，內蒙古烏蘭察布盟四子王旗城巴子北魏墓出土，未定級，保存狀態呈糟朽、污損、內絮絲綿板結現狀，褲長115.5厘米，腰圍102厘米。

②MFB009915：元代素色辮線袍，原所有者不詳，內蒙古出土，未定級，保存狀態有糟朽、污損發生，兩袖通長184厘米，衣長120厘米。

③MFB009916：元代龍鳳紋納石矢辮線袍，原所有者不詳，內蒙古出土，未定級文物，保存狀態有污漬、磨損、皺褶、褪色現象，兩袖通長163厘米，衣長115厘米。

④MFB009917：元代錢字地滴珠窠龍紋辮線袍，原所有者不詳，內蒙古出土，未定級，有污漬、磨損、皺褶、褪色、缺失現象，尺寸為103厘米×90厘米。

⑤MFB9931：元代雜寶團龍紋罟罟冠，原所有者不詳，內蒙古出土，未定級，現存狀態比較完好，尺寸為27厘米×28厘米。

⑥松贊干布遺訓：年代為公元15世紀，來源不詳，文物記錄中有“阿強辦”字樣，初步推測移交自阿里地區文物搶救辦公室，三級文物。由于受潮或水浸，經書整體嚴重粘連板結，揭開的經葉之間有霉;單張經葉尺寸約50.5厘米x12.5厘米。

2.1.2 主要儀器和藥品

AB204-S型電子天平（瑞士梅特勒公司）、CLIMACELL222型恒溫恒濕培養箱（德國3M公司）、MLS-3750型滅菌鍋（日本三洋株式會社）、Scentifid 1358型生物安全柜（美國Thermo公司）、BX41型顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）、化學試劑和培養基。

2.2 培養基及霉菌采集方法

2.2.1 分離培養基

馬鈴薯培養基（PDA）：取200克去皮馬鈴薯，切成小塊，加1000毫升水煮沸30分鐘，用雙層紗布過濾馬鈴薯塊后加入20克葡萄糖、15克瓊脂，之后加水至1000毫升，115攝氏度下高壓滅菌30分鐘;PDB液體培養基（除不加瓊脂外，其他同固體PDA制作方法），用以液體培養。

2.2.2 霉菌采集方法

將無菌棉簽放入直徑6厘米的小培養皿中，用高壓滅菌鍋對其滅菌。在取樣時將無菌棉球在書畫或絲織文物上的霉斑處輕輕擦拭幾次，然后接種到PDA培養基上，最后將PDA培養基放到生物安全柜中在28攝氏度下靜置培養。

2.3 霉菌的分離和純化

將文物霉斑上的取樣涂布于固體PDA培養基，在28攝氏度下的恒溫培養箱中培養4天。進一步根據生長的霉菌代謝產生色素的顏色（主要為黑色、褐色、黃色），對不同真菌進行單菌落劃線純化3次以上。選取菌落特征明顯及色素產生穩定的菌株進行形態學觀察和分子鑒定。

2.4 菌落形態觀察

定期連續觀察菌落的生長速度、外觀、濕潤、顏色變化。用無菌鑷子從插片培養皿里夾取長有霉菌的插片，放入載玻片上，在光學顯微鏡下觀察菌絲和孢子的微觀形態，并進行顯微照相。

2.5 霉菌基因組DNA的提取

把經PDB培養基培養在28攝氏度下恒溫靜置培養3天的菌體離心收集。采用液氮研磨，先用液氮將研缽預冷，然后取樣品平攤到研缽中，倒入液氮停止沸騰之后研磨，重復兩次，裝入離心管。總DNA提取方法按照真菌DNA提取試劑盒（HP Fungal DNA Kit D3195，Omega Bio-Tek公司，美國）的操作說明進行，提取的DNA在零下20攝氏度保存備用。

2.6 真菌ITS基因片段的PCR擴增及測序

擴增引物采用真菌核糖體rDNA間隔區通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。PCR反應體系：PCR Buffer（5x）10微升，dNTP4微升，引物F（終濃度20微摩爾）1微升，引物R（終濃度20微摩爾）1微升，Taq酶1U，模板（終濃度50～100納克）2微升，水31微升。1.5毫升離心管處模板外反應體系一起混合、離心，每個PCR管分裝48微升，然后分別加2微升的真菌基因組DNA。PCR程序采用94攝氏度5分鐘，循環25個94攝氏度30秒、50攝氏度30秒、72攝氏度10分鐘，4攝氏度保存。

PCR產物跑電泳：①瓊脂糖濃度1%，制膠板一般配50毫升，稱取0.5克瓊脂糖加50毫升電泳緩沖液，微波爐加熱至沸騰，冷卻至40攝氏度左右，添加生物染料5微升，倒入制膠板，20分鐘左右凝固;②點樣，5微升樣品及1微升上樣緩沖液;③電泳儀設置電壓120伏，電泳20分鐘;④紫外成像，目的片段在500堿基對左右。目的片段經測序后序列用NCBI在線BLAST比對分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），分析其與已報道真菌ITS序列的同源性，繼而確立所分離菌株的分類學地位。

3 實驗結果

3.1 菌落形態學觀察結果

對所選用樣本中分離純化的單菌落在PDA平板上于28攝氏度下培養3天，觀察發現8株菌株在培養基上顯示出不同的菌落顏色和形態特征。其中部分菌株具有高度發育的菌絲，其他菌株未見明顯菌絲生長。在PDA培養基觀察不同霉菌代謝色素情況，具體結果見表1。對霉菌分離純化后具體菌落形態特征、其產生分生孢子梗及分生孢子的形態特征進行顯微觀察，結果統計如下。

①菌株1：在PDA培養基上生長較快，表面灰綠色，菌絲體呈白色。生長3個月后，霉菌代謝產生大量黑色素。顯微形態觀察發現分生孢子梗光滑，頂端產生近球形定囊（圖1）。

②菌株2：在PDA培養基上表面灰綠色，無明顯白色菌絲體。生長3個月后，霉菌代謝產生大量黑色素。顯微形態觀察發現分生孢子梗粗糙，梗上分生著成串的表面粗糙的球形分生孢子（圖2）。

③菌株3：在PDA培養基上表面灰綠色，背面呈淺黃色。生長3個月后菌株代謝產生黃色色素。顯微形態觀察發現未產生孢子梗，分生孢子呈橢圓形（圖3）。

④菌株4：在PDA培養基上表面呈炭黑色，邊緣呈白色。生長3個月以后菌株代謝產生褐色色素。菌絲體無色，菌絲有明顯橫隔（圖4）。

⑤菌株5：在PDA培養基上表面呈炭黑色，邊緣呈白色。生長3個月以后菌株代謝產生黑色色素。菌絲體無色，菌絲具有明顯橫隔，分生孢子成串、球形（圖5）。

⑥菌株6：在PDA培養基上表面呈灰綠色，菌絲體白色。生長3個月以后菌株代謝產生褐色色素。菌絲體無色，菌絲有橫隔，分生孢子成串、球形（圖6）。

⑦菌株7：菌落在PDA培養基上呈青綠色。生長3個月以后菌株代謝產生褐色色素。分生孢子頂端的膨大，呈掃帚狀（圖7）。

⑧菌株8：菌落在PDA培養基上呈灰綠色。生長3個月以后菌株代謝產生褐色色素。菌絲有橫隔，分生孢子頂端膨大，呈掃帚狀（圖8）。

⑨菌株9：菌落在PDA培養基上呈黃綠色，菌絲體呈白色。生長3個月后，霉菌代謝產生褐色色素。顯微形態觀察發現分生孢子梗光滑，頂端產生近球形定囊（圖9）。

⑩菌株10：菌落在PDA培養基上呈灰綠色。生長3個月后，霉菌代謝產生褐色色素。顯微形態觀察發現分生孢子梗光滑，菌絲有橫隔，分生孢子成串、球形（圖10）。

3.2 分子生物學鑒定結果

將這10株真菌純化后進行液體培養，然后利用真菌DNA提取試劑盒分別提取總DNA進行ITS區的PCR擴增。對純化后的擴增產物18S rDNA序列擴增產物進行測序。測序結果提交到NCBI網站進行比對。發現提交的10個序列與數據庫中參照序列的同源性大于或等于97%（表2）。結果表明菌株1、菌株2、菌株4、菌株5、菌株7、菌株9屬于曲霉屬，另外菌株3、菌株6、菌株8、菌株10屬于青霉屬。

3.3 系統發育樹構建

依據以上菌株18S rDNA序列測序結果利用MEGA軟件構建系統發育樹。

根據系統發育樹（圖11）：菌株1、菌株2、菌株4和菌株5，菌株6和菌株10，菌株3和菌株8遺傳關系較近，分子生物學檢測結果與形態學觀察結果基本相符，這表明該研究的分離霉菌形態特性與進化關系比較準確可靠。

4 討論

我國出土或博物館中保存著眾多紙質及絲織文物，這些文物本身具有較高的藝術價值及文化屬性，因此保護這些寶貴的文物至關重要。然而由于紙質及絲織文物本身的特性以及其出土和保藏環境，導致其表面容易污染霉菌，這些霉菌嚴重影響了文物的保存。①不同的保藏環境導致污染霉菌存在較大差異。唐歡等通過傳統的純培養方法，從紙質書畫霉菌污染處分離出8株霉菌，結果表明8種霉菌屬于曲霉屬、根霉屬和木霉屬。②廖曉迪等對廣西民族博物館4個倉庫、6個展廳中的空氣進行采樣，并對館藏25種各種材質的文物進行采樣，根據空氣中霉菌的總數、種類、分布和霉菌的發生概率對廣西民族博物館進行基礎霉菌調查和分析，發現危害書畫文物的霉菌類屬主要有青霉屬、曲霉屬、毛霉屬等。③本研究選取北京三家文物保護機構的紙質及絲織文物所污染霉菌進行分離、純化、形態學觀察及分子生物學鑒定。通過霉菌分離和純化獲得紙質書畫文物污染的10株典型霉菌。10株菌的菌落形態存在明顯差異，菌落顏色主要為灰綠色和青綠色。從形態學觀察發現分離霉菌為絲狀真菌，菌絲生長發達。通過顯微觀察其分生孢子梗和分生孢子的形態特征，發現其中6株菌（菌株編號1、2、4、5、7、9）具有典型的子囊菌特性，菌落生長較快，表面灰綠色，背面呈黑色或褐色。菌絲發達多分枝，氣生菌絲形成長而粗糙的分生孢子梗，頂端產生燒瓶形或近球形頂囊。基于ITS序列分析菌株1、菌株2、菌株4、菌株5、菌株9都與Aspergillus proliferans的ITS序列相似率大于98%，菌株7與Aspergillus niger的ITS序列相似率大于99%（表2）。曲霉屬是自然界廣泛分布的營腐生生活的真菌屬，該屬包含有超過250個菌種。另外4株菌菌落呈灰綠色，菌絲具有明顯橫隔，頂端不形成膨大的頂囊，分生孢子梗上串生多個球形或橢圓形的分生孢子。基于ITS序列分析菌株3和菌株8與Talaromycesaerugineus的ITS序列相似率大于97%。菌株6和菌株10與Penicillium limosum的ITS序列相似率大于98%（表2）。從以上菌落形態特征和顯微觀察結果，表明北京三家館藏機構的不同保藏紙質和紡織文物樣品由于地理環境相似，主要污染霉菌集中在曲霉和青霉屬，結果與以前閆麗和武望婷等分別在北京館藏文物中分離出的霉菌相似。對霉菌的分離與鑒定研究有助于確定防霉和除霉工作的專一性，故未來對館藏書畫與絲織文物上的其他污染霉菌進行大量的分離與鑒定研究是霉菌研究的新思路。

分離的10株菌株在PDA上生長3個月，長時間生長代謝產生的色素也存在明顯的差異。如表1所示，菌株1、菌株2、菌株4代謝黑色素，其他菌株代謝褐色素。這些色素顏色與霉菌分離文物的污染顏色相一致。菌株1、菌株2、菌株4、菌株5和菌株9從分類鑒定上屬曲霉屬，但其分泌色素顏色不同。菌株3和菌株8都屬于青霉屬，但其分泌色素顏色也存在明顯差異。以上結果表明文物污染霉菌種類非常豐富，分離霉菌后曲霉和青霉屬種間的形態學特性雖然相似，但其分泌色素的代謝途徑存在明顯差異。

綜上所述，本文對北京館藏書畫與絲織文物上的主要10株霉菌進行了分離與分子鑒定研究。從分離霉菌的形態學特性和分子鑒定結果相一致，并且分泌色素的顏色與取樣文物污染顏色相符，說明分離霉菌具有典型的文物污染霉菌特性。對10株霉菌進行系統分析，對未來北京館藏文物上霉菌的研究提出兩點建議：一是文物上的霉菌研究工作應該根據文物污染選取典型樣品，對污染霉屬要進行系統的生物形態學、分子鑒定及色素產生等多因素綜合分析;二是防霉工作應對典型污染霉菌的生長和生理生化特性進行針對性地研究，研發出綠色、清潔、高效的生物防霉新技術。