圓二色和拉曼光譜法分析Ⅰ型膠原蛋白二級結構及熱變性

程 紅， 王 玲

（華中科技大學分析測試中心，武漢 430074）

0 引 言

Ⅰ型膠原蛋白是皮膚、肌腱、骨骼和其他結締組織的主要結構成分，在生物醫學中得到了廣泛的應用。近年來，膠原蛋白已被用于止血海綿、真皮等效物、軟組織增強注射材料、細胞制品基質和藥物輸送載體［1］。此外，膠原蛋白涉及許多病理學，其中成骨不全癥、先天性結締組織發育不全綜合征和纖維化是最嚴重的。在所有這些疾病中，膠原蛋白構象的變化從展開到最終形成和纖顫是主要問題［2］。通過實驗測定蛋白質二級結構，從而預測蛋白質構象可為理解其功能提供重要線索［3］。

研究蛋白質二級結構的常用實驗方法是X-射線衍射和核磁共振波譜。這些技術的數據需要通過計算轉換成原子結構，但如果蛋白質很難分離或結晶，則實驗常常需要在電子結構預測中得到補充［4］。通常α-螺旋、β-折疊和非周期構象中的肽鍵部分可以通過高靈敏度的光學測量來估計，例如圓二色（CD）、紅外（IR）和拉曼（Raman）光譜［5-7］。使用光譜測量來分析二級結構，是評估蛋白質聚集性和穩定性的一個有價值的工具。對于分子生物學中的許多重要問題，如蛋白質折疊、蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質-核酸相互作用，二級結構的定量測量提供了生物功能結構特征的重要線索［3］。光譜技術的優勢是測試非常迅速，所需材料很少，而且可以很方便地考察溫度變化帶來的影響。CD是一種古老的光譜技術，在球形蛋白中研究的比較透徹，但在纖維狀的膠原蛋白中二級結構呈現出一些特殊的特征，如PPII（P2）結構，還需要更全面地理解。IR和Raman同屬于分子振動光譜，兩者相比，后者不易受水峰干擾，可以更容易地檢測出，主要反映在脂質、酰胺、脯氨酸和羥基脯氨酸區的任何構象變化［5］，因此更適合膠原蛋白的二級結構研究［8］。本文采用CD和Raman兩種光譜技術分別對同一種Ⅰ型膠原蛋白的溶液態和固態進行二級結構分析，并觀察隨溫度變化，二級結構發生的改變（即熱變性），旨在為膠原蛋白相關研究提供二級結構分析的實驗參考和技術支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器及試劑

日本Jasco公司J-810型圓二色光譜儀（配有Julabo F12水浴變溫裝置）；Horiba Jobin Yvon公司HR-800型激光共焦拉曼光譜儀（配有Linkam 600型冷熱臺）。所有試劑均為分析純；實驗用水為超純水（電阻率為18 MΩ·cm）。

1.2 樣 品

固態Ⅰ型膠原蛋白：由武漢某生物材料有限公司提供的膠原蛋白海綿，批號：YF19070001，使用前未做任何處理。

溶液態Ⅰ型膠原蛋白：準確稱取一定量的固態膠原蛋白溶于0.01 mol／L乙酸水溶液，配置成濃度為0.1 mg／ml的溶液，于4℃冰箱中放置2 d，使肽段充分折疊。

2 實驗方法與結果分析

2.1 圓二色光譜分析

2.1.1 分析原理

基于對CD光譜的經驗分析，有許多解卷積算法可用于測定蛋白質二級結構含量。這些方法都是利用已知晶體結構的蛋白質的CD譜數據集的信息，從CD譜中計算出感興趣的蛋白質（查詢蛋白）的結構。它們基于這樣的假設：參考蛋白質（reference proteins）的結構在晶體狀態和溶液中相同，并且單個二級結構對CD光譜的貢獻是相加的，如下式［9］：

式中：Cλ指蛋白質的CD光譜，為波長的函數；fi是給定類型的二級結構的分數；Biλ是每種二級結構類型（螺旋、折疊、轉角、無序等）在每個波長下的橢圓度；noise項中包括芳香族側鏈的貢獻。

隨著計算機技術的發展，有一些算法的軟件語言已經變得晦澀難懂，現在仍然可以下載或在線使用的算法包括SELCON3和CDSSTR，它們是基于奇異值分解（Singular Value Decomposition，SVD）方法和變量選擇方法的算法，CONTINLL是使用脊回歸和變量選擇的修改版本，以及神經網絡。所有這些算法都對光譜的大小敏感，因此精確的二級結構分析取決于有良好的校準數據、光譜中的寬波長覆蓋，以及具有與查詢蛋白類似的蛋白質結構特征的參考數據集［9］。

2.1.2 儀器的校準

單色儀的失調會使波長產生微小的偏移，表現為CD峰位的偏移，并對二級結構分析產生重大影響。本文使用有證書的氧化鈥玻璃對波長進行校準。

此外，使用6 mg／mL的d-10-樟腦磺酸銨溶液對光譜強度進行校準，保證圓二色光譜儀處于良好的工作狀態。

2.1.3 光譜的采集

CD測量是在相對稀釋的蛋白質溶液（0.01～0.2 mg／mL）上進行，樣品在感興趣波長范圍內的最大吸光度不得超過2［3］。稀溶液的優點是使樣品的濃度依賴性聚集最小化。本次實驗溶液樣品濃度為0.1 mg／mL，使用同一個池長為0.1 cm的石英比色皿（Type：31／B／Q／1，Starna Scientific Ltd.Hainault，Essex IG6 3UT，United Kingdom）分別裝載背景溶液和樣品溶液進行測試。

為了防止光譜變形，儀器參數的設置也有推薦的經驗選擇［9］，掃描速度×響應時間＜帶寬＜光譜特征寬度／10。如要解析特征寬度為10 nm的光譜，需要小于1 nm的帶寬；如果使用1 s響應時間，則掃描速度不應超過10 nm／min。

本文采用的測試參數為：掃描速度100 nm／min，響應時間0.5 s，帶寬1 nm，累積次數3次。分別采集20、30、40、50、60、70℃下的樣品溶液CD光譜圖。得到的譜圖經過扣除背景、平滑處理后見圖1。

2.1.4 二級結構分析

圖1 不同溫度下膠原溶液的圓二色光譜圖

蛋白質的二級結構是由一組二面角（φ，ψ）決定的，它定義了肽主鏈的空間方向，以及特殊氫鍵的存在。當主鏈二面角有重復值時，肽形成規則的二級結構［3］。膠原蛋白結構為3條平行的多肽鏈，以左旋、聚脯氨酸II型（P2）螺旋構象相互纏繞，1個殘基交錯形成右手三螺旋［10］。三螺旋結構中緊緊包裹著P2螺旋的要求每隔2個殘基就出現1個Gly，這導致了1個重復的XaaYaaGly序列，其中膠原的Xaa和Yaa位置的氨基酸通常分別為（2S）-脯氨酸（Pro，28%）和（2S，4R）-4-羥脯氨酸（Hyp，38%）［10］。因此，膠原蛋白的二級結構中除了局部相鄰氨基酸發生盤曲而形成螺旋、折疊、轉角及無規則卷曲等二級結構以外，還有一個特殊的PPII（P2）螺旋結構。計算時會有一些特殊的要求，比如，按照文獻［11］中介紹的在線計算二級結構的網站，本文選用DichroWeb（http：／／dichroweb.cryst.bbk.ac.uk／html／home.shtml）網站在線計算二級結構，將采集到的光譜數據輸入網址進行數據分析，網站要求reference的設置只能是set5，并且數據的掃描范圍為178～260 nm。選用CONTIN解卷積算法，按照要求輸入后計算結果見表1。

表1 不同溫度下膠原溶液的二級結構計算結果

從表1的數據結合圖1可以看出，在溫度低于40℃時，P2結構隨溫度升高而降低，說明溫度使膠原蛋白的三螺旋發生解旋，P2結構被逐步破壞；而當溫度大于40℃后，α-螺旋結構隨溫度升高逐漸增加，這種構象的轉變引起膠原功能的改變，造成膠原的變性［13］。

2.2 拉曼光譜分析

2.2.1 分析原理

拉曼光譜定義為入射光和散射光頻率之間的差異，該頻率差與鍵的類型及其振動類型有關。特征原子群會產生頻率接近相同的振動帶，而與它們所在的分子無關。在該范圍內的精確波數取決于分子間和分子內的影響，包括肽鍵角度和氫鍵模式。拉曼光譜中酰胺Ⅰ帶和Ⅲ帶通常被用來歸屬蛋白的二級結構，參考具有α-螺旋或β-折疊結構的同型多肽和蛋白質的光譜、理論計算（正態模式分析）、合成肽和具有已知三維結構的蛋白質來確定特定頻率與二級結構［3］。通過酰胺帶相關拉曼光譜指標的變化，可以觀察到從膠原的有序結構（即三螺旋結構）到由于內部（如老化和疾?。┗蛲獠浚ㄈ鐭嶙冃院蜋C械變性）影響而導致向較不有序的結構形式的轉變［7］。

2.2.2 儀器校準

由于每天的溫度和濕度會有差別，導致峰位會有些差異，因此最好能在使用儀器前對峰位進行校正。峰位校正以單晶硅的一階峰（520.7 cm－1）作為參考峰位進行。校正前，確保用于校正的激光器已打開，并且最少預熱10 min，使激光器達到穩定狀態。

2.2.3 光譜采集

在拉曼光譜實驗中，為了獲得最佳的拉曼信號，需要考慮每種激光波長的優缺點。散射的光子數與激光波長間接相關，拉曼線的強度與激光頻率的4次方成正比［14］：

式中：l為拉曼線的強度；ν為激光源的頻率。因此，當比較532 nm激光器和785 nm激光器時，

式中：c為光速；λ為激光源的波長。

可以看出，非共振條件下，532 nm激光產生的拉曼譜線強度比785 nm激光器產生的拉曼線強度強4.7倍。但是在樣品有較強熒光干擾時，可以使用長波長的激光器如785 nm激光器和1 064 nm激光器來減少干擾。

本文采用生物樣本中常用的Nd-YAG：532 nm激光源，光柵600 gr／mm，×50LWD物鏡，200μm針孔，60 s曝光時間，將樣品置于Linkam變溫臺的比色皿中采集不同溫度下的光譜數據，得到的譜圖見圖2。

2.2.4 二級結構分析

拉曼光譜中，酰胺I和酰胺III帶的頻率可以檢測二級結構的差異，該區域與碳氫伸縮振動區（即脂質區，lipids）、脯氨酸和羥脯氨酸區一起是膠原結構構象變化的3個主要區域［5］，如圖3所示（圖示為溫度20℃時固態膠原蛋白的拉曼光譜圖），正是這些二級結構為膠原蛋白提供穩定性和纖維狀結構。酰胺I帶從1 700～1 600 cm－1，是肽鏈振動，主要來源于C＝O伸縮振動（～80%）和C—N伸縮振動和N—H彎曲振動（～20%）。它產生一個非常強烈的信號，并且對蛋白質二級結構敏感；酰胺III帶（～1 310～1 175 cm－1）主要與C—N伸縮振動和N—H彎曲振動（各約30%）、C—C伸縮（～20%）和C—H彎曲（～10%）有關［6］。盡管它的強度很低，大約比酰胺Ⅰ降低80%，但它對蛋白質的二級結構也非常敏感，而且不受吸水率的影響［6］。根據現有的文獻，將指紋區峰值進行歸屬，與二級結構的對應關系見表2。

圖2 固態膠原蛋白的變溫拉曼光譜圖

圖3 反映構象變化的主峰所在3個主要光譜區域

表2 固態膠原蛋白的拉曼光譜指紋區的主要譜峰歸屬及其與二級結構的對應關系

結合圖2和表2可以看出，蛋白質主鏈的C—C伸縮振動峰936 cm－1譜峰的強度隨著溫度升高而降低，至200℃時完全消失，這可能是因為隨著溫度的升高，分子和原子之間的距離也會增加，從而削弱氫鍵和范德華力，導致三螺旋結構的破壞［13］。根據反應二級結構中有序和無序結構對應譜峰的比例關系，可以判斷膠原蛋白的變性與否，比如I1 670／1 640，I1 245／1 270，I1 245／1 454，其中I1 245／1 454逐漸減小，I1 670／1 640，I1 245／1 270逐漸升高，這些峰值強度比可以作為新的光譜生物標志物來評估膠原蛋白的質量和完整性［16-17］。變性過程中這些比值的變化可能反映出膠原二級結構的變化，特別是從有序結構到低有序結構的轉變［17］。根據圖2的數據，以最高峰的峰高為基峰進行歸一化處理，得到這些光譜生物標志物隨溫度變化的值，列于表3。

表3 本次實驗中拉曼光譜生物標志物的強度比

從表3可以看出，固態膠原蛋白的三螺旋結構在200℃以內保持穩定，超過200℃后發生變性。肉眼可見白色的膠原蛋白海綿在200℃變性溫度下開始發黃。該結果與差熱分析（DSC，測試條件：在氮氣氣氛下，以5℃／min的升溫速率從30℃升至250℃，所得譜圖見圖4，在80℃和220℃左右有吸收峰，第1個峰面積和寬度較大，是膠原蛋白海綿失水放熱峰；第2個峰面積較小，是膠原蛋白海綿在熱收縮過程中結構破壞所對應的晶區熔融峰）對應發生熱變性的溫度范圍的結果基本吻合，說明使用拉曼光譜生物標志物來判斷變性是科學可行的。

圖4 固體膠原蛋白的DSC圖

3 結 語

CD是一種廣泛應用的分析蛋白二級結構的光譜技術，該技術可用于區分無序和有序結構。在球形蛋白，如牛血清白蛋白、溶菌酶和α-糜蛋白酶等蛋白中研究的比較透徹，而在纖維狀的膠原蛋白中二級結構呈現出一些特殊的特征，還需要更全面的理解。Raman光譜分析膠原蛋白可以提供很多信息，并且隨著理解的加深，它可以識別由于疾病或老化過程而導致膠原蛋白變化的化學途徑，人們將了解到膠原是如何隨著年齡、疾病和創傷而改變的。目前，拉曼光譜的潛力還沒有被完全挖掘，雖然數據采集速度很快，但數據分析需要相當的技能和時間。因此，基于這兩種光譜技術，本文對溶液態和固態的Ⅰ型膠原蛋白的二級結構進行分析，詳細敘述了實驗原理及實驗過程，考察溫度對于二級結構的影響，該工作可作為膠原蛋白相關研究的實驗引導和示范。實驗結果表明，Ⅰ型膠原蛋白溶液態的變性溫度約為40℃，固態（又稱膠原蛋白海綿）的變性溫度約為200℃，固態比液態穩定，尤其是在室溫范圍內不會變性，這有利于其在臨床上的推廣應用。