柴胡加龍骨牡蠣湯對七氟醚致老年大鼠認知損害的保護作用研究

莫蓓，何佩娟，楊垂勛

1.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006；2.江西省胸科醫院，江西 南昌 330006

七氟醚麻醉的好處是患者術后蘇醒比較快、對呼吸道的作用很溫和［1］，被廣泛運用于老年麻醉。然而近年的研究顯示［2］，老年病人在接受七氟醚麻醉后更容易發生認知方面的問題，經方柴胡加龍骨牡蠣湯常用于神經疾病的診治中［3-4］。但柴胡加龍骨牡蠣湯是否可用于防治七氟醚麻醉導致的術后認知損害，尚無文獻報道。本研究通過觀察經方柴胡加龍骨牡蠣湯對七氟醚所致神經認知障礙的改善作用探討其可能機制，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

1.1.1 實驗動物 本實驗所用動物為96 只18 月齡SPF 級老年SD 大鼠，雌雄各半（長沙天勤生物技術公司，實驗動物合格證號：430047000012185），放置在屏障級標準動物飼養間內飼養。

1.1.2 主要藥品 柴胡加龍骨牡蠣湯（漢方醫藥公司）；七氟醚（濟南仁源公司）；細胞裂解液（武漢友聯特公司）；兔抗鼠NF-κB p65 抗體（南京森貝伽公司）；羊抗兔二抗（杭州格朗瑞公司）；ELISA試劑盒（深圳子科公司）

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、建模及干預 將所有大鼠按隨機數字表法分成單純七氟醚組（S 組）、柴胡加龍骨牡蠣湯預處理組（B 組）、柴胡加龍骨牡蠣湯預處理對照組（BC 組）以及空白對照組（C 組），每組24 只。S 組和B 組建立七氟醚致認知損害模型，B 組以及BC 組給予柴胡加龍骨牡蠣湯干預，C 組對照。步驟：S 組接受麻醉前1 周，每天采用1 mL/100 g 的生理鹽水進行灌胃一次，持續14 d，此后連續3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧氣2 h；B 組麻醉前14 d 每日持續給予1 mL/100 g 的柴胡加龍骨牡蠣湯懸濁液灌胃（按體表面積折算動物給藥劑量），此后連續3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧氣2 h。BC 組接受與B 組相同的預處理，此后連續3 d 吸入空氣2 h。C 組術前每天采用1 mL/100 g 的生理鹽水進行灌胃一次，持續14 d，此后3 d 每日吸入空氣2 h。

1.2.2 Morris 水迷宮觀察大鼠空間學習記憶能力 將大鼠面向圓形桶壁依次從4 個象限入水，放一隱藏平臺，記錄逃避潛伏期。結束后2 h，撤去平臺，大鼠游泳120 s，記錄跨臺次數。

1.2.3 TUNEL 法觀察海馬CA1 區神經元數量 每組選8 只大鼠，取大鼠腦組織，按照TUNEL 試劑盒說明書操作。顯微鏡觀察神經元數量。

1.2.4 ELISA法檢測炎癥因子表達 每組選8只大鼠，取大鼠腦組織，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測炎癥因子表達。

1.2.5 Western blotting 觀察NF-κB p65 表達 用細胞裂解液提取海馬組織蛋白，BCA 法蛋白定量；取50 μg 蛋白在SDS-PAGE 上電泳，NF-κB p65 蛋白抗體，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，常溫孵育l h 曝光成像。β-actin 作內參。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠空間學習記憶能力

1～4 d 時，S 組大鼠的逃避潛伏期比C 組長（P＜0.05），B 組大鼠逃避潛伏期比S 組短（P＜0.05）。S 組大鼠跨臺次數比C 組多（P＜0.05），B 組大鼠跨臺次數比S 組少（P＜0.05）。BC 組與C 組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠逃避潛伏期以及跨臺次數（）

表1 大鼠逃避潛伏期以及跨臺次數（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.2 各組大鼠海馬CA1 區神經元計數

S 組神經元數量比C 組少（P＜0.05）。B 組海馬神經元數量比S 組多（P＜0.05）。BC 組與C 組差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 大鼠海馬CA1區神經元數量（）

表2 大鼠海馬CA1區神經元數量（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織中炎癥相關因子

表3 結果，S 組炎癥因子水平比C 組高（P＜0.05）。B 組炎癥因子水平比S 組低（P＜0.05）。BC 組與C組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表達（）

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表達（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.4 各組大鼠NF-κB p65 的表達

表4、圖1 結果，S 組NF-κB p65 表達比C 組高（P＜0.05）。B 組大鼠NF-κB p65 表達比S 組高（P＜0.05）。BC組與C組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 大鼠NF-κB p65表達（）

表4 大鼠NF-κB p65表達（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

圖1 大鼠NF-κB p65表達（PAGE電泳圖）

3 討論

七氟醚麻醉可能會引發老年病人出現認知功能障礙［5］。海馬是存在于大腦組織一個部分，目前大量關于認知的研究亦集中于海馬［6-7］。本研究結果，接受七氟醚麻醉的大鼠逃避潛伏期變長，跨臺次數變少，這提示在七氟醚麻醉后大鼠的認知的確有障礙，同時，大鼠的海馬區神經元數量也在減少，說明七氟醚對大鼠的海馬結構亦產生了不利的影響。

老年人在受到應激、創傷、麻醉等過程后會誘發機體產生炎癥反應，導致NF-κB 通路的活化，進一步加劇中樞和外周炎癥因子表達，以此來損傷神經元細胞，從而造成認知功能障礙［8-9］。在本研究中，NF-κB 通路被激活，NF-κB p65 表達增多，七氟醚麻醉的老年大鼠腦中IL-1β、IL-6 和TNF-α 顯著高于正常大鼠，提示七氟醚麻醉加劇神經系統產生炎癥反應。

柴胡加龍骨牡蠣湯是一種傳統中藥方劑，能夠對精神疾病有很好的緩解作用［8］。動物實驗也顯示［10］，柴胡加龍骨牡蠣湯也能改善阿爾茨海默病模型大鼠的精神狀態。本實驗結果與之相似，在經過此方干預后，大鼠認知明顯改善，同時，NF-κB p65 表達下調，炎癥因子的水平隨之降低，神經元數上調，提示柴胡加龍骨牡蠣湯會阻礙NF-κB p65的表達，抑制炎癥因子表達，進而減輕對神經元細胞的傷害而發揮作用。另外對正常大鼠使用此方并不會影響大鼠機體各項指標，提示其安全性也比較可靠。