豫谷18 功能葉碳氮代謝關(guān)鍵酶活性研究

王淑君 劉金榮 王素英 劉海萍 閆宏山 宋中強(qiáng)

（河南省安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安陽 455000）

豫谷18 是安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的谷子品種，該品種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、適應(yīng)性廣，適宜在華北、西北、東北三大主產(chǎn)區(qū)種植，被業(yè)界譽(yù)為谷子中的“鄭單958”[1]。碳氮代謝是作物的基本代謝[2]，其協(xié)調(diào)性影響作物光合產(chǎn)物的形成和轉(zhuǎn)化、礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收以及蛋白質(zhì)合成等[3]，進(jìn)而影響植株生長發(fā)育[4]，決定作物產(chǎn)量的高低[5]。碳氮代謝包括無機(jī)碳的同化、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累，無機(jī)氮的還原、同化及有機(jī)含氮化合物的轉(zhuǎn)化、合成等[5]，在這一系列過程中碳氮代謝關(guān)鍵酶起著決定性作用。本文通過研究豫谷18 籽粒灌漿期功能葉中碳氮代謝關(guān)鍵酶活性變化，以期為高產(chǎn)谷子育種、栽培調(diào)控及提高谷子產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試品種為安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的谷子品種豫谷18，對照為河北省農(nóng)林科學(xué)院選育的谷子品種冀谷19（CK）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)于2017 年在安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地（36°6′N、114°2′E）進(jìn)行。土壤為壤土，水澆地，肥力均勻，前茬作物為小麥。試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組排列，4 次重復(fù)，小區(qū)面積20m2，6 行區(qū)，行距0.4m；6 月23 日播種，留苗密度60 萬株/hm2。第1 個(gè)重復(fù)為取樣區(qū)，另外3 個(gè)重復(fù)為測產(chǎn)區(qū)，田間管理同常規(guī)大田管理。

谷穗完全抽出旗葉后，掛牌標(biāo)記生長一致、同時(shí)抽穗開花的植株。開花后7d、14d、21d、28d、35d 各處理取掛牌標(biāo)記植株旗葉和倒2 葉，液氮速凍。

1.3 測定方法標(biāo)準(zhǔn)樣品的稀釋與加樣 在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)樣孔10 個(gè)，在第1、2 孔分別加標(biāo)樣100μL、標(biāo)樣稀釋液50μL，混勻；從第1、2 孔中各取100μL 分別加到第3 孔和第4 孔，再加標(biāo)樣稀釋液50μL，混勻；第3、4 孔中先各取50μL 棄掉，再各取50μL 分別加到第5、6 孔中，加標(biāo)樣稀釋液50μL，混勻；重復(fù)上述操作直至各孔加樣量都為50μL。

酶活性測定 在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL。用封板膜封板后置于37℃溫育30min。將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s 后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外，繼續(xù)溫育洗滌。加入顯色劑輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，加終止液50μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸還原酶硝酸還原酶（NR）是植物將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶和限速酶[6]，其活性高低不僅體現(xiàn)了植物體內(nèi)硝酸鹽的吸收、積累水平，氮素的同化利用水平[7]，還可反映植物光合、呼吸作用以及蛋白質(zhì)的合成能力[8]。

由圖1、圖2 可知，整個(gè)灌漿過程中，2 個(gè)品種功能葉NR 活性均呈單峰曲線變化。豫谷18 功能葉NR 活性在開花后14d 達(dá)到峰值，冀谷19 旗葉和倒2 葉NR 活性分別在開花后14d 和21d 達(dá)到最大值，說明豫谷18 在開花后14d 左右為葉片氮同化的關(guān)鍵時(shí)期，隨著生育期推遲，NR 活性下降。2 個(gè)品種旗葉和倒2 葉NR 活性分別在開花21d 和28d 后下降幅度趨于平緩。整個(gè)灌漿過程中，豫谷18 功能葉的NR 活性高于冀谷19，說明豫谷18 的氮素利用水平、光合作用及蛋白質(zhì)合成能力等高于冀谷19。

圖1 豫谷18 旗葉NR 活性

圖2 豫谷18 倒2 葉NR 活性

2.2 谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶（GS）參與多種氮代謝調(diào)節(jié)，是氨同化和谷氨酰胺形成的關(guān)鍵酶[9]，其活性降低可使細(xì)胞內(nèi)多種氮代謝酶和部分糖代謝受到嚴(yán)重影響[10]。

由圖3 可知，籽粒灌漿過程中，2 個(gè)品種旗葉GS 活性呈下降趨勢。開花后7d，豫谷18 和冀谷19旗葉GS 活性相當(dāng)；隨著生育期推進(jìn)，豫谷18 的GS活性緩慢下降，冀谷19 則下降幅度較大。由圖4 可知，開花后7～28d，2 個(gè)品種倒2 葉GS 活性均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢；開花后35d，GS 活性豫谷18 略有上升，冀谷19 保持平穩(wěn)。整個(gè)過程中豫谷18 的GS 活性高于冀谷19，說明豫谷18 功能葉氮代謝能力較強(qiáng)，有利于氮素的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而形成較高的蛋白質(zhì)含量，促進(jìn)籽粒產(chǎn)量的提高。

圖3 豫谷18 旗葉GS 活性

圖4 豫谷18 倒2 葉GS 活性

2.3 蔗糖磷酸合成酶蔗糖磷酸合成酶（SPS）是碳源向可逆碳水化合物分配的關(guān)鍵酶[11]，在碳代謝中起著重要作用，其活力大小直接影響光合產(chǎn)物在淀粉和蔗糖之間的分配[12]，調(diào)控著葉源中可溶性糖含量及對庫端的供應(yīng)能力。SPS 活力越高，合成蔗糖的能力越強(qiáng)[13]。

由圖5、圖6 可知，豫谷18 功能葉SPS 活性在開花后隨生育期推進(jìn)呈下降趨勢；冀谷19 功能葉SPS 活性呈先升高后降低的趨勢，旗葉和倒2 葉分別在開花后21d 和14d SPS 活性最高。灌漿過程中，豫谷18 功能葉SPS 活性高于冀谷19。開花后0～35d 是籽粒形成的關(guān)鍵時(shí)期，豫谷18 的SPS 活性較高，蔗糖合成旺盛，為籽粒形成提供充足的碳源，促進(jìn)籽粒發(fā)育，減少敗育。

圖5 豫谷18 旗葉SPS 活性

圖6 豫谷18 倒2 葉SPS 活性

2.4 谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶（GDH）是碳氮代謝轉(zhuǎn)化過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)碳氮平衡。在逆境及碳骨架受限時(shí)，GDH 催化谷氨酸脫氨作用為三羧酸循環(huán)提供充足的碳骨架，保障碳代謝的正常進(jìn)行[11]，尤其是植物生長發(fā)育后期對催化合成谷氨酸具有重要作用[14]。因此，GDH 活性高低直接影響到作物籽粒蛋白質(zhì)的合成[15]。

由圖7 可知，2 個(gè)品種旗葉GDH 活性變化表現(xiàn)一致，均是先升高后降低，在開花后14d GDH 活性最大，越接近成熟，GDH 活性越小；酶活性下降過程中，豫谷18 下降幅度較平緩。整個(gè)過程豫谷18 GDH 活性高于冀谷19，說明豫谷18 功能葉碳代謝能力相對較強(qiáng)。由圖8 可知，豫谷18 倒2 葉GDH活性在開花后7～14d 變化不大；14d 后迅速下降，21d 后GDH 活性下降幅度較小，基本維持在一定水平；冀谷19 GDH 活性在開花后7～21d 下降較快，21d 后趨于穩(wěn)定。說明豫谷18 倒2 葉在開花后14d仍能維持較高的GDH 活性，有利于催化合成谷氨酸，促進(jìn)籽粒蛋白質(zhì)的合成。

圖7 豫谷18 旗葉GDH 活性

圖8 豫谷18 倒2 葉GDH 活性

3 結(jié)論與討論

作物產(chǎn)量形成的實(shí)質(zhì)是源-庫互作的過程，源、庫數(shù)量及其協(xié)調(diào)性對作物產(chǎn)量具有重要意義；碳氮代謝關(guān)鍵酶活性高低影響著作物源庫數(shù)量與平衡，進(jìn)而影響產(chǎn)量[16]。王文靜等[17]研究認(rèn)為SPS 調(diào)節(jié)葉片中的可溶性糖含量和對庫端的供應(yīng)能力，SPS活性高顯示出源端較強(qiáng)的同化物持續(xù)供應(yīng)能力。申麗霞等[18]研究認(rèn)為較高的GDH 活性有利于催化和加速合成谷氨酸，特別是在產(chǎn)量形成的重要時(shí)期，維持葉片較強(qiáng)的碳代謝是制造較多光合產(chǎn)物以滿足籽粒產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在產(chǎn)量形成關(guān)鍵期，豫谷18 功能葉NR、GS、SPS、GDH 活性均高于對照品種冀谷19。在幾種酶的共同作用下，有利于豫谷18 維持和延長葉片功能期，增加CO2同化和干物質(zhì)積累，增強(qiáng)光合作用及蛋白質(zhì)合成等方面能力，葉片光合產(chǎn)物能夠向庫端有效地運(yùn)輸和分配，從而為籽粒產(chǎn)量的提高奠定了重要基礎(chǔ)。