固相支撐液液萃取- 超高液相色譜- 串聯質譜法測定全血中啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒殘留量

方雅莉

（廣東醫科大學科研服務管理中心，廣東 東莞523808）

新煙堿類殺蟲劑是一類高效的殺蟲劑，目前在世界上應用廣泛[1]。它的獨特優勢在于其具備一定的選擇性，殺蟲高效避免了很多害蟲對氨基甲酸酯等傳統類別的殺蟲劑所產生的抗藥性，因此被廣泛使用于瓜果蔬菜等糧食作物的除蟲。人們一度認為新煙堿類殺蟲劑對哺乳類動物風險較低，是因為它與哺乳動物的乙酰膽堿受體的親和力低。但經過研究表明，新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物不像當初設計的那么安全。由于此類殺蟲劑在瓜果蔬菜等農作物中大范圍使用，使得其在水體和土壤中的積累量逐年增加，通過膳食和飲水攝入成為人群暴露于新型煙堿類殺蟲劑的主要途徑。由于大范圍的使用已對人群造成潛在的風險。據研究表明，吡蟲啉和啶蟲脒是樣品中檢出率最高的新煙堿類殺蟲劑，中華人民共和國農業部第199 號公告明確禁止使用殺蟲脒這一類高毒殺蟲劑[2]。生態流行病學調查顯示, 長期接觸殺蟲脒的工人膀胱癌發生率是普通工人的72 倍[3]，并在他們的尿中檢出了代謝產物4-氯鄰甲苯胺。同樣，據研究顯示，吡蟲啉能夠延緩部分動物胚胎的發育[4,5]，啶蟲脒能夠明顯降低鳥類的精子密度[6]。因此，建立一種快速高效的對血液中的啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒殘留量檢測方法很有必要，目前，應用最廣泛的樣品前處理方法是固相萃取[7-13]與液液萃取[14-18]。固相萃取重現性好且萃取柱價格適宜，一般較受青睞，但是上樣前要將萃取柱活化、平衡及清洗，使的樣品前處理步驟變得復雜，費時耗力，樣品量少時可以使用。液液萃取利用目標物在兩相中溶解度不同，來達到有效分離的目的，常用的有機溶劑有乙酸乙酯、二氯甲烷等，但是液液萃取需要的溶劑多，萃取過程中需要不斷的充分振蕩、離心，操作復雜，且液液萃取容易發生乳化現象，導致重現性差。綜上可知，固相萃取和液液萃取兩種前處理方法都無法滿足流行病學調查中大量樣本處理的需求。因此，急需一種簡單易行的前處理方法來檢驗全血中的啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒。固相支撐液液萃取柱的填料為惰性處理的硅藻土，具有疏松多孔的特點，加之表面活性低，比表面積高，相比傳統的液液萃取方法，能夠提供更大的液液分配支撐界面。傳統液液萃取方法容易發生乳化現象，導致回收率偏低，除雜效果差，容易發生交叉污染，固相支撐液液萃取方法能夠有效避免傳統液液萃取的不足，操作過程僅需上樣、靜置、洗脫三步，省去了振蕩、離心，取上層溶液等操作，整個過程不形成乳濁液，是生物、食品和環境樣品的理想選擇。相較于液液萃取、固相萃取等傳統的樣品前處理方法，固相支撐液液萃取能有效提高樣品中目標物的提取富集效率，在人體生物樣品的前處理上廣泛應用[29-24]，而且能夠對目標物進行高通量的分析。本文采用固相支撐液液萃取作為前處理方法，以人體血液中的啶蟲脒、殺蟲脒、吡蟲啉為目標物，利用高效液相色譜質譜聯用儀對目標物進行定性定量檢驗，結果表明，可以對生物體液中的啶蟲脒、殺蟲脒、吡蟲啉進行快速高效的檢驗。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正戊烷、乙醚、乙腈、甲醇(色譜級，99.9%，德國Merck 公司) ; 醋酸鈉和甲酸 ( 99.97 %，美國Tedia 公司) ; HCl( 質量分數為37%，德國Sigma-Aldrich 公司) ;實驗用水為超純水( 18.2 MΩ·cm) ; 吡蟲啉（德國Dr 公司）；啶蟲脒（中國ANPEL 公司）；殺蟲脒（德國Dr 公司）；空白血1 份。

1.2 儀器

液相色譜儀( LC，日本島津公司) -三重四極桿質譜儀( MS /MS，美國AB SCIEX 公司) ;臺式離心機(美國Thermo Fisher 公司); 氮吹儀(瑞典Biotage 公司);6 孔固相萃取裝置(中國睿科公司) ;超純水儀(美國Millipore 公司) ; 振蕩器（德國IKA 公司）;0.22 μm 尼龍膜濾頭(德國CNW 公司) ; 5 mL SLE 固相支撐液液萃取小柱(瑞典Biotage 公司)。

1.3 溶液配制

混合標準工作溶液的配制：精確稱取殺蟲脒、啶蟲脒、吡蟲啉對照品適量，分別置于50 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分搖勻的基礎上超聲促溶，配制成1 mg/mL 標準儲備液，用移液槍各取適量標準儲備液于甲醇水（V/V 1:1）中，配制成100 μg/mL 的標準工作液，備用。Ph 為10 的緩沖溶液配制：準確稱取KH2PO40.064 g，Na2HPO45.020 g，于1000 mL 容量瓶中，用去離子水溶解并定容，充分搖勻，配制成Ph 為10 的緩沖鹽溶液。

1.4 樣品前處理

將樣品解凍后，準確量取1 mL，加入1mL Ph 為10 緩沖溶液，振蕩3 min，8000 r/min 離心5 min，取上清液，加入20ng 內標SKF525a，充分混勻。將樣品加入固相支撐液液萃取小柱中，1 分鐘內上樣完畢，等待5 min，使樣品分散并充分吸附于填料表面。以4 mL 乙酸乙酯沖洗萃取柱，連續洗脫2 次，將兩次收集的洗脫液合并氮吹并吹干，以甲醇定容至400 μL。用0.22 μm 的尼龍膜過濾后，備檢。

1.5 儀器分析

UPLC 色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，ID 1.7μm，美國Waters 公司）；流動相A：0.1%甲酸+5mmol/L 乙酸銨的超純水；流動相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；進樣體積：1μL；梯度洗脫程序：0～2 min，90 % B; 2～2.5 min，90 %～50% B; 2.5～3 min，50 % B; 3～3.5 min，50 %～90 %B; 3.5～6 min，90%B。質譜條件：電噴霧離子源(ESI )，正離子模式，多掃描方式：多反應監測（MRM）。質譜離子源參數：CUR：35；CAD：Medium；IS ：5500；TEM：450；GSI：50；GS2：50。

各目標化合物保留時間和定性定量離子對見表1。

表1 殺蟲脒、吡蟲啉、啶蟲脒的質譜參數及色譜保留時間

2 實驗條件優化

2.1 質譜條件的優化

結合殺蟲脒、啶蟲脒、吡蟲啉的化學結構式，選擇ESI(+)的電離模式，使用注射針泵分別注入500 ng/mL 的藥物標準品。殺蟲脒、啶蟲脒、吡蟲啉的分子量分別為196，222，255，在m/z 100-500 的掃描范圍內進行全掃描，在一級全掃描質譜中得到母離子質量數[M+H]+的分子離子峰。調節儀器參數，分別選擇[M+H]+作為母離子進行二級質譜掃描分析，自動優化確定最高及次高響應的二級離子m/z 以及相應的DP、CE、CXP 等參數，具體見表2。（質譜參數表1）。

2.2 色譜條件的優化

本論文分別研究了含有0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸銨和0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸銨的超純水作水相；乙腈、甲醇作為有機相，以靈敏度和峰形作為評判條件，最終發現含有5 mmol/L 醋酸銨和0.1%甲酸的超純水作水相，乙腈作為有機相，選擇梯度洗脫，以相對高的流速低比例的有機相作為起始流動相，提高分析效率和靈敏度。

2.3 前處理方法優化

生物樣品成分復雜，一般對目標物的干擾比較大，前處理的目的就是為了最大限度除去干擾，保證儀器性能的同時，獲得較高的目標物回收率。本實驗分別對比了3 種常用的前處理方法。(1)蛋白沉淀法：取0.5 mL 樣品，加入2.0 mL 90 %（V/V）乙腈水沉淀蛋白，充分振蕩10.0min 后，8000r/min 離心取上清液，過0.22μm 濾膜后直接進行儀器檢測。(2) HLB 固相萃取法：準確移取血液0.5mL，加入pH=6 的緩沖溶液0.5mL。振蕩1.0 min 后將混合液8000r/min離心取上清液，HLB 萃取住活化后，上樣淋洗后先在5 000 r/min下離心5 min，然后氮吹吹干，乙酸乙酯洗脫，洗脫液氮吹吹干后用初始流動相溶解，過0.22 μm 尼龍濾膜后直接上樣。(3) 固相支撐液液萃取法：準確移取樣品血液0.5 mL，加入pH = 10 的緩沖溶液0.5mL。充分振蕩1min 后上樣，1min 內要完成上樣全過程，使得樣品全部均勻分散在填料上后，靜置5.0 min 左右。用4mL*2 乙酸乙酯洗脫萃取柱，輕微加壓，流速在1.0 mL/min 左右。合并兩次洗脫液氮氣吹干，用初始流動相定容至0.5 mL，過0.22 μm 尼龍膜，濾液供UPLC-MS/MS 分析。對比上述3 種前處理方法，乙腈直接沉淀蛋白法，容易產生基質效應，結果不穩定，回收率約為65 %，固相萃取法稍有不慎便會堵塞柱子，耗時長，回收率約為60 %。縱觀固相支撐液液萃取法，提取效率高，操作簡單，回收率能達到90% 以上，滿足實際使用要求。

2.4 固相支撐液液萃取柱洗脫溶劑的選擇

本實驗選取了環己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚作為洗脫溶劑進行優化，通過3 種目標物的回收率進行評價。相關結果見表2，二氯甲烷溶解性較大，易洗脫部分非目標物，乙醚沸點太低，易揮發，綜合考慮，洗脫溶劑選擇乙酸乙酯。

表2 固相支撐液液萃取柱洗脫溶劑的優化

2.5 方法評價

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

上述實驗條件優化好后，進行方法學的考察。取空白全血5 份各0.5 mL，分別配制成5、10、50、100、500 ng/mL 標準品。經過固相支撐液液萃取法進行前處理后，進行儀器分析。以不同濃度目標物的峰面積進行線性回歸，結果表明啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒3 種藥物在5～500 ng/mL 范圍內有良好線性關系，相關系數為0.9983～0.9992，以3 倍信噪比（S/N）對應的添加水平作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對應的添加作為定量限（LOQ），結果見表3。

表3 三種藥物的線性方程、相關系數、檢出限

2.5.2 方法回收率和精密度

方法采用空白血樣添加標準混合目標物方式，在空白血樣中分別添加5.0、50.0、500.0 ng/mL 標準品，每個濃度血樣平行配制3 份樣品。按照上述的方法進行處理。通過對比峰面積計算回收率，見表4。

表4 三種藥物的回收率和精密度

3 結論

本實驗采用固相支撐液液萃取進行樣品前處理，以UPLC-MS/MS 對血液中的啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒同時進行分析。通過對質譜條件和前處理方法的優化，建立了同時檢測全血中啶蟲脒、吡蟲啉、殺蟲脒，LLE-UPLC-MS/MS 分析方法。本方法快速靈敏、回收率高，能夠滿足實際使用需求。