醫(yī)療廢水中糞大腸菌群多管發(fā)酵法檢測(cè)及改進(jìn)探討

江鑫晨

（上海新天地檢測(cè)技術(shù)有限公司，上海200000）

1 概述

調(diào)研國(guó)內(nèi)外檢測(cè)方法可知，針對(duì)糞大腸菌群的檢測(cè)方法包括有紙片快速法、多管發(fā)酵法、酶底物法以及濾膜法，各種檢測(cè)方法所得到的糞大腸菌群的濃度結(jié)果有所差異，但整體來看均能反應(yīng)出污水中糞大腸菌群的濃度狀況，筆者通過對(duì)項(xiàng)目中收集的醫(yī)療廢水采用多管發(fā)酵法進(jìn)行糞大腸菌群的檢測(cè)實(shí)踐，并在此基礎(chǔ)上提出了部分改進(jìn)探討，項(xiàng)目具有一定的參考價(jià)值。

2 樣品和方法

2.1 主要儀器

本文根據(jù)監(jiān)測(cè)要求選用的儀器主要有恒溫培養(yǎng)箱，其溫度控制在37℃±0.5℃；常規(guī)用到的滅菌和培養(yǎng)相關(guān)設(shè)備；小型的實(shí)驗(yàn)冰箱，溫度控制在2℃～5℃；天平：感量0.1g；振蕩器；無菌吸管：1mL（具0.01mL 刻度）、10mL（具0.1mL 刻度）、微生物實(shí)驗(yàn)所用到的移液器和匹配型號(hào)的吸頭；經(jīng)過滅菌處理的錐形瓶，其容量約520mL；經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿，其直徑90mm。

2.2 樣品和試驗(yàn)環(huán)境

根據(jù)要求，本試驗(yàn)環(huán)境需要處于環(huán)境潔凈度不低于10000 級(jí)的無菌室，樣品包括一瓶醫(yī)療廢水，編號(hào)1；一瓶陽(yáng)性對(duì)照水樣，編號(hào)2，一瓶滅菌蒸餾水做空白對(duì)照，編號(hào)3。

2.3 檢測(cè)方法

本試驗(yàn)采用多管發(fā)酵法檢測(cè)醫(yī)療廢水中的糞大腸菌群，標(biāo)準(zhǔn)參考《醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 18466-2005）中的附錄A。

2.4 試劑及培養(yǎng)基情況

試劑包括兩種：革蘭氏染色液和滅菌的生理鹽水，濃度約0.9%；培養(yǎng)基包含四種物料，主要用含有乳糖的蛋白胨培養(yǎng)液、含有乳糖的膽鹽培養(yǎng)液、微生物實(shí)驗(yàn)中的EC 培養(yǎng)液以及EMB培養(yǎng)基。

3 檢驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)具有檢驗(yàn)的步驟，通過檢驗(yàn)后還需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。

3.1 檢驗(yàn)過程

在確定水樣污染程度的基礎(chǔ)上混合后來進(jìn)行三個(gè)水樣量接種，三個(gè)水樣需要采集5 個(gè)水樣管，針對(duì)未受到污染的水樣采集約0.1mL、1mL 以及10mL。在針對(duì)相對(duì)污染嚴(yán)重水樣接種量跟前個(gè)步驟一致，接種完之后進(jìn)入稀釋步驟，稀釋比約為1:10：100，稀釋后的水量需要盡量少于1mL，根據(jù)要求，需要取稀釋比以此為1：10：100，稀釋方法參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)下盛入10mL 的滅菌水管中，然后均勻混合，經(jīng)過監(jiān)測(cè)后達(dá)到1：10：100 的比例。其他稀釋比根據(jù)以上方法也需要進(jìn)行相應(yīng)的稀釋，根據(jù)不同濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)液，制作成不同培養(yǎng)液樣品，針對(duì)前期稀釋的樣品后在進(jìn)入初發(fā)酵試驗(yàn)。

發(fā)酵的溫度需要控制44℃±0.5℃，時(shí)間控制在24h±2h。試驗(yàn)過程針對(duì)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管標(biāo)記為試驗(yàn)陽(yáng)性。通過試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性后需要分開進(jìn)行培養(yǎng)，將含有乳糖膽鹽培養(yǎng)基伊紅美蘭平板進(jìn)行接觸劃線，在這個(gè)階段需要調(diào)整試驗(yàn)溫度，控制在37℃±0.5℃，時(shí)長(zhǎng)同上。接著根據(jù)觀察菌落形態(tài)來進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢以及后期的證實(shí)，其特征的菌落包括有一種是深紫黑色具有金屬光澤或者不帶金屬光澤的菌落；另外一種為淡紫紅色菌落，中心顏色較深。

3.2 證實(shí)方法

證實(shí)主要通過雙料乳糖膽鹽培養(yǎng)液進(jìn)行證實(shí)，水樣取10mL，雙料乳糖膽鹽培養(yǎng)液取5mL，除此之外還需要通過取無菌的生理鹽水和1mL 樣品進(jìn)行混合然后注入到單料乳糖膽鹽培養(yǎng)液管，同樣此類型樣管需要取5 管，溫度控制44℃±0.5℃，時(shí)長(zhǎng)為一天，其他注意事項(xiàng)同檢驗(yàn)過程。

4 結(jié)果

根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)目，從大腸菌群MPN 表（參考《醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 18466-2005）中的附錄A）中查得MPN 指數(shù)，接種5 份10mL 水樣，5 份1mL 水樣，5 份0.1mL 水樣時(shí)，查表1 求得MPN 指數(shù)，MPN 值再乘10，即為1L 水樣中的糞大腸菌群。如果接種的水樣不是10mL、1mL、0.1mL，而是較低的或較高的三個(gè)濃度的水樣時(shí)，也可查表1 求得MPN 值，再經(jīng)下式計(jì)算成每100mL 的MPN 值，計(jì)算方法如下：

表1 乳糖膽鹽初發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

具體試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。

發(fā)酵管會(huì)有產(chǎn)酸產(chǎn)氣的現(xiàn)象，針對(duì)此種樣品需要轉(zhuǎn)接種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，溫度控制在37℃±0.5℃，時(shí)長(zhǎng)約一天。觀察菌落形態(tài)，具體如表2 所示。

表2 分離培養(yǎng)情況

挑取可疑菌落革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果如表3 所示。

表3 革蘭氏染色鏡檢

通過染色結(jié)果將具有革蘭氏陰性無芽孢桿菌的染色鏡與乳糖蛋白胨培養(yǎng)液互相混合接種，溫度控制在44℃±0.5℃，時(shí)長(zhǎng)為一天，如果出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的現(xiàn)象，此濃度便為陽(yáng)性糞大腸菌群（表4）。

表4 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

表7 改進(jìn)法與多管發(fā)酵法置信值符合程度

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，在查閱MPN 檢索表并且計(jì)算后1L 水樣中的糞大腸菌群結(jié)果如表5 所示，空白對(duì)照結(jié)果為陰性，未檢出糞大腸菌群，結(jié)果與預(yù)選設(shè)計(jì)一致，所以此方法檢出糞大腸菌群較為準(zhǔn)確。

表5 糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果

5 改進(jìn)方法探討

本文改進(jìn)方法調(diào)研國(guó)內(nèi)外研究成果，主要選取了EC 培養(yǎng)法、5 管法和10 管法以及蛋白胨培養(yǎng)法。EC 培養(yǎng)法的在前期不需要經(jīng)過發(fā)酵處理，直接放于EC 培養(yǎng)液中，將溫度保持在44.5℃，保持24h 后通過查表法計(jì)算結(jié)果；5 管法和10 管法試驗(yàn)前需要將樣品稀釋，稀釋后的5 管水樣分別包括有100、10、1、0.1 以及0.01mL，10 管法根據(jù)條件取得每種水樣接種5 管，其他試驗(yàn)流程參照多管發(fā)酵法；蛋白胨培養(yǎng)法只需要將樣品導(dǎo)入至乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h 再繼續(xù)觀察結(jié)果，采取以上改進(jìn)方法進(jìn)行檢測(cè)后，檢測(cè)結(jié)果均在多管發(fā)酵法置信范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果為可接受，具體如表6、7 所示。

表6 改進(jìn)法與多管發(fā)酵法監(jiān)測(cè)結(jié)果一覽表

通過分析改進(jìn)法與多管發(fā)酵法相關(guān)系數(shù)可知，各改進(jìn)法與多管發(fā)酵法相關(guān)性較高，其中10 管法、EC 培養(yǎng)法相關(guān)系數(shù)均在0.89 以上，5 管法相關(guān)系數(shù)為0.74，蛋白胨培養(yǎng)法相關(guān)系數(shù)較低，僅為0.48，因此在具備各種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上蛋白胨培養(yǎng)法并非最優(yōu)選擇，通過10 管法和EC 培養(yǎng)法檢測(cè)所得的糞大腸菌群才具備很大的參考價(jià)值。