原發性膽汁性膽管炎肝內小膽管上皮細胞損傷的免疫學機制

楊雅斐，鄧志華

山西醫科大學第二醫院 消化內科，太原 030001

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以肝內小膽管慢性、進行性破壞為特征的自身免疫性疾病[1]。肝臟免疫耐受的打破和免疫系統的異常激活造成肝內小膽管上皮細胞(biliary epithelial cells，BEC)進行性、連鎖性損傷，形成免疫級聯破壞反應。

1 PBC肝臟免疫耐受的打破

正常情況下，當低濃度抗原進入肝內，肝內的抗原呈遞細胞如Kupffer細胞、肝竇內皮細胞和樹突狀細胞通過下調主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)分子的表達以阻斷抗原的加工和處理，并且下調共刺激分子CD80和CD86的表達、分泌TGFβ促進調節性T淋巴細胞(regulatory T cell, Treg)的分化來抑制效應T淋巴細胞的增殖，從而維持肝臟免疫耐受[2-3]。

PBC的發生受遺傳和環境因素影響[1]。全基因組關聯研究[3-4]發現，位于6號染色體短臂上的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)等位基因中HLA-DQA1、DQB1、DRB1、DPB1和IL-12A在內的40個非HLA基因是PBC的易感基因位點。PBC的免疫攻擊是針對一種普遍存在的線粒體抗原，即丙酮酸脫氫酶復合物E2亞基(the E2 component of pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2)的脂酰結構域的硫辛酸結合殘基。帶有PBC易感基因的宿主接觸外界抗原后在體內將這些抗原代謝或與自身分子結合，形成與PDC-E2結構相似的新抗原而導致機體免疫反應激活、肝臟免疫耐受被打破[5-6]。

2 PBC小膽管上皮細胞的凋亡

肝內小膽管的內壁由BEC構成[6]。當大量外源性物質(如細菌脂多糖、食物抗原、化學品、藥物等)從腸道吸收經門靜脈循環通過肝內小膽管時，BEC通過其表面的Toll樣受體主動結合脂多糖等外界抗原，并分泌細胞因子和趨化因子如IL-6、IL-8、TNFα、CX3CL1等吸引肝內外免疫細胞使自身凋亡[5,7-9]。與其他細胞不同的是，當BEC啟動自身凋亡時，其內的谷胱甘肽對PDC-E2巰基的共價修飾使PDC-E2抗原表位暴露，引發B淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞、NKT細胞和T淋巴細胞相繼激活并靶向攻擊鄰近的BEC；損傷的BEC將PDC-E2轉運到凋亡小體中，后者被鄰近的正常BEC吞噬，引起一系列針對BEC的免疫級聯反應[6-7,10]。

2.1 血清抗線粒體抗體(antimitochondrial antibodies，AMA)的產生 BEC被攻擊后暴露出PDC-E2，激活抗原特異性B淋巴細胞，后者增殖并分泌IL-6、IFNγ和TNFα促進Th1、Th17細胞增殖分化啟動對其他BEC的損傷，同時抗原特異性B淋巴細胞分化為漿細胞產生大量AMA[11-12]，凋亡小體中的PDC-E2被AMA識別并與之結合為AMA-載脂蛋白復合物，進一步激活巨噬細胞而引發周圍的BEC損傷[13]。

2.2 固有免疫細胞的參與 巨噬細胞響應BEC分泌的趨化因子信號被募集到肝臟中，AMA-載脂蛋白復合物刺激巨噬細胞,后者通過腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體直接攻擊BEC并產生IL-6、IL-1β、IL-8、IL-12和TNFα，促進周邊BEC大量凋亡[13]。此外，巨噬細胞表達的炎癥小體NOD樣受體蛋白-3的激活，促進炎性因子如IL-18、IL-1β的釋放，進而促進了BEC的凋亡[7]。

Fu等[14]利用PBC小鼠模型發現，高濃度脂多糖刺激Kupffer細胞產生TNFα和IL-12，這些細胞因子一方面作用于BEC，另一方面刺激NK產生INFγ介導BEC損傷[14-15]。NK/BEC比值的變化[16]決定NK對小膽管的損傷程度；將NK與BEC共培養，在NK/BEC低于0.5時，NK通過分泌IFNγ促進BEC上MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子的表達，NK上的抑制型受體即殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)易與MHC-Ⅰ類分子結合，抑制NK對BEC的殺傷活性、保護BEC免受NK的裂解；在NK/BEC高于0.5時，BEC表面的MHC-Ⅰ類分子表達減少或缺失，導致KIR與MHC-Ⅰ類分子的結合減少，NK對BEC的保護作用減弱，同時NK表面的活化型受體NKG2D與巨噬細胞表面的MHC-Ⅰ類相關鏈A結合，使NK激活并直接攻擊BEC[13-14,16]，導致小膽管的碎裂。在PBC患者的外周血和肝臟中，NK細胞數量持續增加并靶向攻擊BEC[13]，使BEC損傷并減少，NK/BEC比例失衡引發持續的小膽管損傷。此外，BEC通過向NKT呈遞脂質抗原，下調表達MHC-I類分子CD1d，導致NKT分泌IFNγ并通過FasL途徑介導BEC損傷[5,17]。固有免疫細胞不僅直接參與凋亡BEC的靶向攻擊，還參與損傷周邊正常的BEC并維持持續的炎癥反應，最終導致了小膽管大量損傷(圖1)。

2.3 CD8+T淋巴細胞的殺傷啟動 Zhao等[18]的研究表明，在PBC早期，肝內小膽管周圍存在大量PDC-E2特異性的CD4+和CD8+T淋巴細胞。CD8+T淋巴細胞通過細胞死亡受體Fas結合BEC上的FasL、釋放穿孔素和顆粒酶這兩種方式來造成BEC的直接損傷[13,18]。最近，Li等[16]發現，表達殺傷細胞凝集素樣受體G1(KLRG1)的CD8+T淋巴細胞可分泌大量的穿孔素和顆粒酶，KLRG1+細胞與血清堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶呈正相關，這可能是BEC嚴重損傷的重要原因。

2.4 CD4+T淋巴細胞的增殖分化

受傷的BEC釋放出完整的PDC-E2后，抗原呈遞細胞一方面通過MHC-Ⅱ類分子將PDC-E2呈遞給CD4+T淋巴細胞，另一方面通過CD80和CD86共同刺激T淋巴細胞的CD28受體使CD4+T淋巴細胞分化為Th1、Th17細胞(圖1)，進一步參與BEC損傷[13]。

2.4.1 Th1細胞對BEC損傷早期的主導作用 PBC患者中，除了巨噬細胞等抗原呈遞細胞以外，CD19+CD24hiCD38hiBreg細胞也產生大量IL-12[19]；IL-12與CD4+T淋巴細胞表面IL-12受體結合，使轉錄激活蛋白4(signal transducer and activator of transcription 4, STAT4)的酪氨酸和絲氨酸磷酸化,誘導STAT4移動至Th1細胞的細胞核并結合轉錄因子ERM從而激活Th1細胞[20-21]；激活后的Th1細胞分泌IFNγ導致大量BEC損傷；IFNγ是導致小膽管損傷的關鍵因素，在PBC基因易感宿主中上調IFNγ的表達可使肝臟免疫耐受喪失，IFNγ還能激活巨噬細胞向“M1”型轉變，使其產生大量IL-12、IL-23和TNFγ等促炎性細胞因子，正反饋促進Th1細胞反應[22]。在PBC早期，IL-12/Th1型細胞因子在小膽管周圍占主導地位，且肝內Th1細胞和Th17細胞處于相對平衡狀態，當疾病向晚期進展時，Th1/Th17平衡向Th17偏移[22]。

2.4.2 Th17細胞對BEC損傷進展的促進作用 受到外界抗原持續刺激的BEC可產生大量IL-6、IL-1β和IL-23等細胞因子；CD4+T淋巴細胞在TGFβ和IL-6共同存在時促進視黃酸相關的孤兒受體γt的表達并分化為Th17細胞。Th17細胞分泌IL-17與BEC表面的IL-17受體結合促進BEC產生更多的IL-6、IL-1β和IL-23，從而使Th17細胞不斷產生與成熟[23-24]。Sun等[25]發現，PBC患者外周血IL-17水平明顯高于正常人，且與血清谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉移酶水平呈正相關。IL-17誘導BEC產生趨化因子如CXCL2、CXCL6和CCL20來吸引Th1、Th17細胞向BEC周圍聚集并損傷BEC。PBC早期患者的外周血中Th17細胞比例明顯高于晚期患者，但PBC晚期患者的肝內Th17細胞比例高于早期患者[7,24]。以上說明，晚期小膽管的損傷主要以Th17為主，且Th17及產生的IL-17促進疾病向晚期發展,與PBC預后有關。因此，靶向IL-17的免疫治療可能有助于改善PBC的病情及預后。

2.4.3 Treg細胞減少對BEC損傷的間接促進作用 當不存在促炎性因子時，TGFβ可促進CD4+T淋巴細胞分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg[24]。Chen等[26]發現，PBC患者的Treg數量及其產生的IL-10水平相比正常對照組明顯下降。Liaskou等[27]的研究表示，與正常對照組相比，PBC患者的Treg對低水平的IL-12敏感，并表達較高水平的IL-12受體β2與IL-12結合，促使STAT4磷酸化進而促進Treg轉化為Th1細胞，導致Treg減少。Treg產生減少并被誘導凋亡或轉化為其他類型細胞，使其無法有效抑制效應T淋巴細胞增殖與分化，從而間接促進了小膽管的損傷。

體外擴增Treg的細胞療法可用于治療自身免疫性疾病。近年來，利用基因工程技術在Treg中表達嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)已經在各種動物疾病模型研究中有所收獲。CAR-Treg可遷移到具有特定抗原的靶器官，通過分泌穿孔素和顆粒酶以及FasL途徑來誘導效應T淋巴細胞凋亡，并且CAR-Treg上的CTLA-4與T淋巴細胞的CD28競爭結合抗原呈遞細胞上的CD80/CD86抑制效應T淋巴細胞的活化[28]。目前CAR-Treg細胞療法對PBC患者的療效尚未清楚。

圖1 免疫系統對BEC的作用

3 小結

肝臟免疫耐受喪失是PBC發生發展的重要原因，免疫系統異常激活造成肝內小膽管上皮細胞損傷，其中涉及的免疫反應包括以巨噬細胞、NK、NKT細胞為主的固有免疫反應和以Th1細胞、Th17細胞、B淋巴細胞為主的適應性免疫反應。近40年來，熊去氧膽酸作為唯一被批準的抗膽汁淤積藥一直主導著治療，但仍有部分PBC患者對熊去氧膽酸治療反應欠佳。PBC免疫靶向治療的有效藥物尚未出現。因此，明確PBC發生發展的免疫學機制將有助于為PBC的診斷、疾病的監測、新藥的制備提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：楊雅斐負責課題設計，查閱文獻，撰寫文章；鄧志華負責指導、修改文章。