基于土大黃苷定性定量檢測的大黃類中藥摻偽鑒定方法研究進展

陳雪，辛杰,2，王振,2，張波,2

(1.臨沂大學藥學院，山東 臨沂 276005；2.山東省魯南中藥材工程技術研究中心，山東 臨沂 276005)

大黃為蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Balf.)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃等多種功效，屬于臨床常用中藥材之一[1]。由于大黃市場需求量及消耗量均較大，利益驅使下易出現人為摻偽現象，再者大黃為多基源植物藥，且正品大黃與同屬偽品大黃[如華北大黃(R.franzenbachiiMunt.]、河套大黃(R.hotaoenseC.Y.Cheng et Kao)、藏邊大黃(R.emodiiWall.)、疏枝大黃(R.spiciformeRoyle等)在性狀及顯微特征方面較難鑒別，也容易造成客觀上的誤用、錯用等現象發生[2]。因此，多種因素作用下導致市售大黃藥材或含大黃的中成藥中出現摻偽現象，如李敏等[3]對收集自25個廠家的3種大黃飲片共計60個批次樣品進行質量考察，結果發現生大黃、酒大黃和熟大黃飲片的摻假率分別為50%、47%和41%，質量問題之大令人擔憂；又如樊寶娟等[4]對市售112批含大黃制劑中的大黃用料和15批大黃飲片真偽進行抽檢，結果發現112批制劑中32批大黃投料摻偽，且15批大黃飲片中9批為偽品；可見大黃摻偽現象十分嚴重。因此，加強大黃類藥材真偽鑒定方法研究，對保障大黃的用藥安全性和有效性具有重要意義。

目前，大黃真偽鑒定方法主要有性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定和分子鑒定等多種方法，但性狀鑒定及顯微鑒定準確性偏低，而分子鑒定則技術要求和檢測成本偏高，比較而言，理化鑒定則兼顧準確性及可操作性強等優點，在實際應用中較為廣泛[2]。土大黃苷(rhaponticin，RHA)為二苯乙烯衍生物，主要存在于河套大黃、華北大黃、藏邊大黃、疏枝大黃等大黃屬植物中，自1990年版《中國藥典》首次明確指出RHA可作為真偽大黃鑒定的指標性成分以來，基于RHA定性定量檢測的大黃真偽鑒定方法得到了廣泛應用[5]。

大黃類藥材種類繁多，包括大黃生藥、炮制品(酒大黃、熟大黃、大黃炭)以及含大黃的中藥制劑，據統計《中國藥典》2015年版共收載含大黃的制劑153種，占制劑總數的10.2%，且制劑中大黃的比重差異顯著[6]。繁雜的藥物種類和眾多的劑量差異，給大黃藥材及制劑中大黃投料的真偽鑒定帶來了極大挑戰。如何利用RHA的特異性來實現大黃原料的有效鑒定？顯然，藥典提供的薄層色譜法(TLC)尚不能完全解決這個問題。因此，為充分發揮RHA在大黃類藥材真偽鑒定過程中的重要作用，本文分別對2000年1月-2020年1月發表的相關文獻進行檢索，對RHA在大黃類藥材真偽鑒定中的應用做一綜述，以供參考。

1 TLC

TLC具有操作簡單、檢測快速、結果直觀、檢測成本低等優點，在有對照品的情況下可實現目標物的定性檢測，在《中國藥典》的【檢查】項中應用十分廣泛。對于大黃生藥及其飲片(包括炮制品)，《中國藥典》2015年版采用聚酰胺薄膜為固相載體，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸(30∶5∶5∶20∶0.1)為展開劑，通過在365 nm紫外燈下檢識，以“在與對照品色譜相應的位置上，不得顯相同的亮藍色熒光斑點”作為判斷真偽大黃的依據[1]。

而對于含大黃的中藥方劑，由于處方中其他藥材的化學成分可能與RHA存在干擾，導致上述檢測條件無法實現RHA的良好分離，因此對于方劑中RHA的TLC鑒定方法在固相載體和展開系統方面均有所變化。《中國藥典》2015年版僅明確了2個處方(九味肝泰膠囊和三黃片)中大黃類藥材要進行RHA定性檢測[1]，相對于共計153個含大黃的處方來說少之又少。鑒于此，本文收集整理了更多含大黃的制劑中RHA的TLC檢測方法(見表1)，以供法參考。

表1 TLC法檢測RHA在大黃類藥材及其制劑真偽鑒定中的應用

由表1可知，在含大黃的中藥復方制劑TLC檢測RHA研究中，硅膠G板為固相載體應用較廣，而與之對應的展開系統以“三氯甲烷-甲醇-甲酸-水”為主；而以聚酰胺薄膜為固相載體的展開系統以“甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸”為主。

2 高效液相色譜(HPLC)

TLC方法雖然簡便易行，但部分學者研究顯示TLC存在色譜圖清晰度不足，辨識困難等問題，且提出HPLC分離度更好、靈敏度更高，更適用于RHA的檢測，有利于大黃藥材的去偽存真[16]。近年來，多位學者基于HPLC技術開展了針對正品大黃、偽品大黃及含大黃的中藥制劑中RHA的定性定量檢測方法研究。由于通過RHA的有無即可定性判斷大黃類藥材的真偽，因此較多學者僅利用HPLC進行RHA的定性檢測，但也有學者通過定量檢測同時結合主成分分析法來判斷大黃類藥材的真偽[17]，詳細信息見表2。

表2 HPLC檢測RHA方法參數表

由于部分中成藥中大黃組分比例較小，導致即使投料為偽品的情況下直接采用HPLC仍無法檢測RHA是否存在。為解決這一問題，Chen等[31]以Fe3O4為磁組件，RHA為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，苯乙烯為共聚單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，二甲亞楓為致孔劑，通過懸浮聚合法制備了磁性分子印跡聚合物，并將其用于富集中成藥提取液中的RHA，然后再利用HPLC進行定量檢測。該方法對RHA的最低檢測限達6.63 μg·L-1，檢測范圍為0.59～713.6 nmol·L-1，適用于闌尾消炎片、排毒養顏膠囊、大黃蟄蟲膠囊和三黃片等中成藥中RHA的檢測。

3 超高液相色譜(UPLC)

與HPLC相比，UPLC靈敏度和分離效率更高，檢測速度更快。任偉光等[32]以ACQUITY BEH C18色譜柱為分析柱，采用梯度洗脫的方式，建立了同時檢測大黃樣品中包括RHA在內的8種化合物的UPLC檢測方法。該方法分析效率高，整個檢測時間在9 min內完成，其中RHA的檢測范圍為2.02～129.44 μg·mL-1。

4 液質聯用技術(LC-MS)

LC-MS結合了色譜和質譜的優勢，通過LC實現化合物分離，然后通過MS的離子峰信息(包括一級、二級或多級質譜離子峰)對待測樣品進行定性鑒別，其靈敏度和準確性更高。

孫愛萍等[33]采用LC-MS/MS技術建立了中成藥麻仁丸中偽品大黃RHA的定性檢測方法，其中HPLC條件為：資生堂C18色譜柱，流動相為0.01 mol·L-1醋酸銨-乙腈(40∶60)；MS采用ESI-離子源。測試結果顯示：RHA對照品保留時間為26 min，準分子離子[M-H]-峰為m/z 419，主要碎片離子m/z為257和241。通過與對照品離子峰對比檢測，受驗14批麻仁丸中有10批檢測到RHA，即說明投料摻有偽品大黃。

楊萍等[34]則以ESI+為離子源，建立了中成藥一清顆粒中RHA的定性檢測方法，結果顯示RHA的準分子離子峰[M+H]+m/z為421，二級質譜離子掃描RHA碎片離子峰m/z包括259、227、199和135。

此外，LC-MS在RHA的藥代動力學研究中發揮重要作用。Zhao等[35]通過UHPLC-DAD-MSn技術確認了RHA([M+H]+m/z 421)的代謝產物為丹葉大黃素(RPG，[M+H]+m/z 259；二級m/z 241、226.9、199、149、135、107.1)；并基于UHPLC-Q-TOF/MS技術建立了RHA和RPG在大鼠血清中的檢測方法。

以上研究可知，LC-MS檢測RHA的定性主要依據離子峰信息為RHA的一級準分子離子峰和RPG相關的二級離子峰信息。

5 毛細管電泳法(CE)

尚小玉等[36]建立了快速分離大黃類藥材中大黃酚、大黃素、大黃酸和RHA等4種成分的膠束電動毛細管色譜法(MECC)，通過單因素實驗對條件進行優化后(緩沖液為50 mmol·L-1H3BO3-NaOH含緩沖液為20 mmol·L-1SDC，pH 10，分析電壓17 kV)，可在5 min內完成4種成分的全部分離。然后其通過環糊精修飾對MECC進行了進一步優化，建立了基于環糊精修飾的混合MECC內標定量法用于分離、測定大黃類藥材中的6種化學成分，在最優條件下(緩沖液為20 mmol·L-1硼砂緩沖液含20 mmol·L-1SDC，20 mmol·L-1STC和15 mmol·L-1β-環糊精，pH 10.5～11.1，分析電壓17 kV)，RHA檢測范圍為5～80 μg·mL-1，整個分析時間在25 min以內[37]。

Yang等[38]利用β-環糊精作為調節劑，建立了RHA、RPG及兩者異構體分離檢測的毛細管區帶電泳法(CZE)，該方法可在3 min內完成樣品分析，通過紫外可見分光光度法和核磁共振檢測分離后的樣品，證實該CZE準確高效。

6 化學發光測定法(CLA)

在硫酸酸性介質條件下，高錳酸鉀可以直接氧化RHA而產生較強的化學發光，基于此，木合塔爾·吐爾洪等[39]結合流動注射技術，建立了一種快速準確和簡便的RHA含量測定方法，該CLA對RHA的檢測限和定量限分別為0.2 ng·mL-1和0.6 ng·mL-1。

7 結語

作為大黃類藥材的真偽鑒定特異性成分，RHA的主要定性定量檢測方法包括TLC、HPLC、UPLC、LC-MS、CE和CLA等，其中TLC對飲片類藥材及含大黃組分較多的中成藥的鑒定可以取得理想效果，且方法簡便快速；但對于大黃用量較低的中成藥的RHA檢測仍需借助HPLC、UPLC或LC-MS進一步驗證，或檢測前進行RHA的富集。此外，CE法在RHA的分離與檢測方面十分高效，具有較好的開發潛力。對于CLA法，其在中藥的復雜基質中能否實現RHA的準確檢測還有待進一步研究。

中藥質量好壞是保障臨床安全有效的關鍵，中藥鑒定的核心任務之一即是確保藥材的真實性，目前中藥鑒定已由傳統鑒定手段向現代鑒定技術發展，且發展十分迅速，然而基于化學成分鑒定仍是目前主流鑒定依據之一，而真偽鑒定特異性成分是眾多鑒定工作者苦苦尋覓的目標，但是可遇而不可求。但對于大黃這一臨床應用廣泛且制劑豐富的具體藥物而言，RHA是藥典已確認的真偽鑒定指標化合物，因此，應充分利用RHA的特異性深入開發大黃及含大黃的中藥制劑的真偽鑒定技術，進一步完善藥典標準。建議：①針對藥典中收載的所有含大黃的中藥制劑首先利用TLC法進行RHA檢測，建立TLC檢測標準；②對于TLC無法確認的，可進一步建立HPLC或LC-MS技術鑒定RHA；③開發靈敏度高、特異性強且操作簡便的RHA快速檢測技術(如基于免疫檢測原理的可視化試紙條技術)，以達到廣泛適用和現場化鑒定的需求。