離子液體超聲輔助協(xié)同萃取中藥天麻指標成分的研究

段新新，王莉，吳仁安，鄧仕任，夏林波

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連116600；2.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連116023)

天麻(GastrodiaelataBlume)為蘭科植物天麻的干燥塊莖，其氣微，味甘，性平，歸肝經(jīng)。天麻具有息風止痙[1]、平抑肝陽、祛風通絡的功效，可用于治療肝風內(nèi)動、驚癇抽搐、眩暈、頭痛、肢體麻木、手足不遂、風濕痹痛等,同時還有抗抑郁的作用[2]。天麻中含有天麻苷、多糖、香莢蘭醇、香蘭醛、維生素A、琥珀酸、β-谷甾醇、黏液質(zhì)等多種成分[3]，其中含量較高的主要成分是天麻苷，也稱天麻素。天麻素具有鎮(zhèn)定和安眠的作用，通常用來治療頭暈目眩、失眠多夢、神經(jīng)衰弱等。近年來有關天麻的指標成分研究領域比較重視。巴利森苷類成分是由天麻素和檸檬酸組成，具有熱不穩(wěn)定性，酯鍵易斷裂發(fā)生降解，在一定條件下，易與天麻素相互轉(zhuǎn)化，且含量遠高于天麻素及其苷元[4]。以巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E和巴利森苷G為代表，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 巴利森苷類化合物結(jié)構(gòu)式

目前，天麻中天麻素及巴利森苷類化合物的提取方法主要有超聲波提取法[5-6]、浸提法、回流提取法[7-8]、微波萃取[9]和酶解提取法[10]等，提取溶劑主要有甲醇、乙醇、水。這些溶劑提取率低，能耗大，且易造成環(huán)境污染等問題。室溫離子液體是由一個有機陽離子和一個有機或無機陰離子組成的液態(tài)有機鹽，與傳統(tǒng)有機溶劑相比，離子液體具有極性可調(diào)控、熱穩(wěn)定性好，液態(tài)范圍寬、蒸汽壓小[11]等特點，此外離子液體還可根據(jù)目標化合物的性質(zhì)，通過改變陰陽離子的組合或基團的引入以提高對目標化合物的提取率[12]，是一種可替代傳統(tǒng)溶劑的新型綠色溶劑[13]，在天然產(chǎn)物提取方面廣受關注[14-16]。目前，基于離子液體對天麻指標成分提取的工藝鮮有文獻報道。

根據(jù)現(xiàn)有文獻[17-22]所提到過的天麻的指標成分提取及質(zhì)量控制，將天麻素及巴利森苷類化合物同時作為天麻指標成分進行考察更為全面。因此，本試驗以天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E及巴利森苷G為指標，通過離子液體結(jié)合超聲輔助的方法對天麻進行提取，并運用質(zhì)譜法檢測研究，通過考察影響提取率的主要因素以確立最佳提取條件。由于不同因素可能對各指標成分提取效果的影響有所不同，因此在后續(xù)實驗中，以各指標成分離子強度的加和作為主要考察指標來進行提取條件的優(yōu)化。天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E和巴利森苷G在負離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 巴利森苷類化合物在負離子模式下的高分辨質(zhì)譜參數(shù)

由于巴利森苷B與巴利森苷C，巴利森苷E與巴利森苷G為同分異構(gòu)體[26]，因此這4種物質(zhì)分別考察巴利森苷B與巴利森苷C、巴利森苷E與巴利森苷G離子強度的加和。

1 儀器與材料

1.1 儀器 FSJ-A03D1粉碎機(小熊電器股份有限公司)；QTSXR20500型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；HSE-12B型固相萃取裝置(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；HGC-12A型氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；SolariX XR-15T傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICR-MS,Bruker Daltonics,德國)；電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；Centrifuge 5804R艾本德冷凍離心機。

1.2 材料 中藥飲片天麻，購于大連市益春堂大藥房(西安路店)，產(chǎn)于安徽亳州中強中藥飲片有限公司，經(jīng)中國科學院大連化學物理研究所王莉教授鑒定為中藥天麻飲片；甲醇為分析純；試驗用水為超純水；離子液體1-丁基-3-甲基咪唑乙酸鹽([BMIM][CH3COO],純度98%，深圳市益百順科技有限公司)；1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([BMIM][Cl]，純度97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1-丁基氯化吡啶([BPY]Cl，純度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 方法學考察

2.1 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜系統(tǒng)采用ESI電噴霧離子源負離子模式掃描：流速2 μL·min-1；掃描范圍(m/z)46～1 500；分辨率240 000；霧化氣壓1.0 bar；毛細管電壓4.5 kV；干燥氣溫度200 ℃，流速4.0 L·min-1；離子累積時間0.1 s。

2.2 精密度試驗 取天麻粗粉100 mg,加入1 mL 70%甲醇水溶液，浸泡30 min后超聲60 min，離心(4 ℃，14 000 r·min-1)10 min，取上清液，過SPE(C18)柱除去離子液體，水洗后再用甲醇洗脫。將收集到的洗脫液氮氣吹干，再加2 mL 70%甲醇水溶液復溶，再次離心后取上清液，按“2.1”項下條件進行質(zhì)譜檢測。連續(xù)進樣3次，根據(jù)各指標成分的離子強度計算RSD。結(jié)果天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B/C、巴利森苷E/G的RSD分別為0.82%、1.18%、2.67%和2.85%，表明儀器具有較好的精密度。

2.3 重復性試驗 取天麻粗粉3份，其他操作同“2.2”項下。結(jié)果天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B/C、巴利森苷E/G的RSD分別為3.88%、13.78%、2.37%、13.46%，3份樣品測定值的相對標準偏差均低于15%，表明本法具有較好的重復性。

3 提取條件的考察

3.1 單因素考察

3.1.1 離子液體的考察 取天麻粗粉4份，每份100 mg，放入離心管中，分別加入70%甲醇及濃度為0.5 mol·L-1不同離子液體的70%甲醇水溶液，離子液體分別為[BMIM][CH3COO]、[BMIM]Cl、[BPY]Cl，料液比1∶10，浸泡30 min后超聲60 min，離心10 min(4 ℃，14 000 r·min-1)，取上清液，過SPE柱(C18)除去離子液體，水洗后再用甲醇洗脫。將收集到的洗脫液氮氣吹干，各加2 mL 70%甲醇水溶液復溶，再次離心10 min(4 ℃，14 000 r·min-1)后取上清液，按“2.1”項條件進行質(zhì)譜檢測，連續(xù)進樣3次，取平均值，觀察不同離子液體提取的天麻指標成分的離子信號強度，結(jié)果如圖2。

由圖可知，[BMIM][CH3COO]、[BMIM]Cl、[BPY]Cl 3種離子液體對天麻素及巴利森苷A、B、C、E、G的提取效果均明顯強于70%甲醇水溶液。其中，提取天麻素及巴利森苷A時，[BMIM][CH3COO]的效果最好,其他均為[BPY]Cl的提取效果最好。因3種離子液體與甲醇比較，都具有較高的提取效率，后續(xù)將在正交分析中進一步考察三者的影響。

3.1.2 離子液體濃度的考察 取中藥天麻粗粉6份，每份100 mg，分別加入濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5 mol·L-1的[BPY]Cl-70%甲醇水溶液1 mL，其他操作同“3.1.1”項下，考察離子液體濃度對天麻指標成分提取的影響(見圖3)。

圖3 離子液體濃度對天麻指標成分提取的影響(n=3)

結(jié)果表明，[BPY]Cl-70%甲醇水溶液濃度為1.5 mol·L-1時，對天麻素及巴利森苷A的提取效果遠高于其他濃度，而其濃度為0.5或1 mol·L-1時對巴利森苷E、G的提取效果更好。此外，離子液體濃度對巴利森苷B及巴利森苷C的提取效率無明顯影響。綜合6個指標成分的離子強度，選擇提取天麻指標成分的[BPY]Cl-70%甲醇水溶液濃度為1 mol·L-1。

3.1.3 甲醇體積分數(shù)的考察 取中藥天麻粗粉5份，每份100 mg，放入離心管中，加入濃度為1 mol·L-1的[BPY]Cl的甲醇水溶液，甲醇的體積分數(shù)分別為30%、50%、70%、90%、100%，其他操作同“3.1.1”項下，考察甲醇體積分數(shù)對天麻指標成分提取效果的影響，見圖4。

圖4 甲醇體積分數(shù)對天麻指標成分提取的影響(n=3)

結(jié)果表明，[BPY]Cl-甲醇水溶液中的甲醇體積分數(shù)為50%時對天麻素及巴利森苷A的提取效果遠高于其他，而甲醇體積分數(shù)為100%時對巴利森苷B/C、E/G的提取效果較好。綜合6個指標成分的提取效果，選擇的[BPY]Cl-甲醇水溶液中的甲醇體積分數(shù)為100%。

3.1.4 料液比的考察 取中藥天麻粗粉4份，每份100 mg，放入離心管中，加入濃度為1 mol·L-1的[BPY]Cl-甲醇溶液，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g·mL-1)，其他操作同“3.1.1”項下，考察料液比對天麻指標成分提取的影響，見圖5。

圖5 料液比對天麻指標成分提取的影響(n=3)

結(jié)果表明，當料液比為1∶5或1∶20時，1 mol·L-1[BPY]Cl-甲醇溶液的對天麻素、巴利森苷A、B、C的提取效果均好于其他，而料液比為1∶5時，對巴利森苷E、G提取效果最好。綜合6種指標成分，提取效果最好的料液比為1∶5。

3.2 正交試驗優(yōu)化提取參數(shù) 根據(jù)上述試驗結(jié)果，選擇離子液體種類(A)、離子液體濃度(B)、提取溶劑甲醇的體積分數(shù)(C)、料液比(D)作為因素進行考察，以分子離子峰的相對強度作為考察指標，進行正交試驗，不考慮因素間的交互影響，進一步優(yōu)化天麻中指標成分的提取工藝。正交試驗因素水平表如表2所示。由于料液比過小會導致取樣困難，因此在本次正交試驗中選用料液比1∶5、1∶10、1∶15三個水平進行試驗。正交試驗結(jié)果見表3。

表2 正交試驗因素水平表

取天麻粉末9份，每份100 mg，按照4因素3水平正交試驗表進行試驗設計，在此條件下對天麻中指標成分進行提取，比較總指標成分的分子離子峰相對強度。

由表3中R值可看出，各因素對天麻總指標成分提取量的影響大小順序依次為：A>C>B>D，即離子液體種類>甲醇體積分數(shù)>離子液體濃度>料液比。通過分析可知，離子液體-超聲波輔助法提取中藥天麻中指標成分較佳的提取條件為：A2B1C1D1，即離子液體[BMIM]Cl，離子液體濃度0.5 mol·L-1，甲醇體積分數(shù)50%，料液比1∶5(g·mL-1)。

表3 正交試驗結(jié)果

3.3 最佳提取工藝驗證試驗 取天麻粉末3份，每份100 mg，分別以最佳提取工藝(A2B1C1D1)進行萃取，結(jié)果3份樣品的分子離子峰加和強度分別為1.26、1.31和1.28，平均值為1.28。由數(shù)據(jù)可知，正交法所得到的離子液體協(xié)同超聲輔助提取最佳工藝穩(wěn)定可靠，具有一定的實際應用價值。

4 討論

離子液體協(xié)同超聲輔助提取是一種新型、綠色的提取方法，相比于傳統(tǒng)溶劑，該方法的提取效率更高，其原理可能為：①離子液體可與被提取物發(fā)生氫鍵作用、疏水作用等分子間作用力[12]；②離子液體對纖維素有良好的溶解能力，細胞壁的主要成分就是纖維素[26]。

試驗所用到的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀具有分辨率高、精密度好、操作簡便快捷等優(yōu)點，能夠很好地檢測ESI電噴霧離子源產(chǎn)生的多電荷離子，在中藥提取及化合物解析方面具有較高的應用價值及前景。

本試驗對中藥天麻指標成分的提取工藝進行了考察及優(yōu)化，該工藝操作簡單、節(jié)能、環(huán)保、高效，是提取天麻素及巴利森苷類化合物的有效方法，為離子液體超聲輔助協(xié)同提取天麻指標成分提供參考。