東鄉野生稻原生境土壤微生物群落結構研究

汪麗娜，賴發英，周春火，尹 鑫

(江西農業大學 國土資源與環境學院，江西 南昌 330045)

1 引言

土壤中含有種類豐富且數量巨大的微生物，這些微生物不僅僅是土壤物質轉化和養分循環的推動者，還是土壤中植物有效養分的儲備庫，對植物生長、氣候調節等生態功能起著不可替代的重要作用[1]，所以土壤微生物受到的關注日益增加。而稻田是最大的人工濕地生態系統，稻田土壤中微生物對調節土壤營養物質的循環，維持土壤肥力具有重要意義。東鄉野生稻(Oryza rufipogon)是在1979年首次報道發現的[2]，是我國三大野生稻之一，具有抗病蟲、抗旱、抗寒等特性[3～5]，是國家二級保護植物。迄今，人們對東鄉野生稻進行了廣泛的研究，但多是以野生稻為個體研究[3～7]，而基于16S rDNA基因高通量測序對東鄉野生稻中土壤微生物研究較少。

本文選取東鄉野生稻的3個不同生境點以及一個對照點的土壤作為研究對象，分別對土壤基于16S rDNA基因 V3-V4 可變區和功能基因的進行高通量測序，對不同生境點與栽培稻土壤中細菌群落結構及多樣性，以及各樣點中固氮菌的群落結構分布進行分析，進一步探究東鄉野生稻與栽培稻中土壤微生物群落多樣性差異性及與環境因子的相關性。

2 材料與方法

2.1 試驗方案

本研究供試土壤取自江西省東鄉縣東鄉野生稻原位保護區內，采樣深度為0～20 cm。三個保護區共設置3個采樣點以及一個栽培稻對照點位(Contrast)，其中俺家山原生境點 (DY 1)；馬池塘原生境點設置一個采樣點(DY 2)；水桃樹下原生境保護點設置一個采樣點(DY 3)。取樣時間為2019年11月，每個點位取0-20cm土層的混合土樣。土壤樣品分別置于標記好的無菌自封袋內排盡空氣，在低溫保溫箱中放置，并在 24 h內帶回實驗室處理并保存。將部分樣品-20 ℃保存供分子生物學分析， 剩余樣品保存于 4 ℃以供后續理化性質分析。

有效磷采用0.5 mol/L NaHCO3法，堿解氮采用堿解擴散法，全氮采用半微量開氏法，速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法每個樣品設置 3 個平行，上述測定方法見參考文獻[8]。

2.2 基于16S rDNA和功能基因的微生物群落結構分析

使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒提取DNA，并用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，引物序列如表1所示，由杭州聯川生物技術股份有限公司(下文簡稱“聯川生物” )對基因進行測序。基于功能基因的高通量測序與普通的16S rDNA 測序方法相似，只是測序前期需要針對目標功能基因收集相應的序列信息， 再針對目標基因設計通用擴增引物。 本研究固氮菌使用的功能基因為固氮酶鐵蛋白nifH。

表1 實驗中涉及到主要引物

3 結果與分析

3.1 土壤理化性質分析

從表2可以看出，東鄉野生稻田土壤中樣品DY2的含量高于DY1、DY3的含量；而對照組CK有效磷明顯高于野生稻田土壤。野生稻田土壤中速效鉀含量DY1的含量高于DY2、DY3；而對照組含量明顯高于野生稻。樣品全氮含量中樣品DY2的含量高于DY1、DY3的含量；而對照組CK明顯高于野生稻田土壤。野生稻田土壤中堿解氮含量中DY1含量最小，對照組堿解氮含量低于野生稻。除堿解氮外，對照組土壤理化指標均高于東鄉野生稻原生境土壤。

表2 土壤理化性質

3.2 土壤細菌Alpha多樣性指數

利用基于16S r DNA基因的高通量技術，對3個東鄉野生稻的稻田土壤以及對照組栽培稻的土壤樣品以97%的序列相似度作為分類閾值，共獲得275 176條16S rDNA V3-V4序列，有效序列聚類后共獲得7957個OUT。測序數據大于Q20%的平均有效率為96.35%(±0.05)，大于Q30%為90.32%(±1.08)，測序數據的有效率均高于90%，這表明測序數據較好且可靠。各土壤樣品的覆蓋率均為1.00，能夠反映出各水稻田土壤中微生物群落結構的真實情況(表3)。東鄉野生稻原生境土壤(DY)中Shannon指數及Chao1指數均高于栽培稻(Contrast)，其中點位DY1的指數差異最為明顯，這表明東鄉野生稻土壤中微生物多樣性高于栽培稻土壤。

表3 土壤微生物群落Alpha多樣性分析

3.3 土壤細菌群落結構分析

為了解東鄉野生稻與栽培稻兩種類型土壤微生物群落結構的差異，對聚類后的OTU序列進行注釋，4個水稻田土壤樣品中細菌OTU屬于61門157綱326目495科742屬。將相對豐度排名低于30的以及在該水平上沒有注釋結果的細菌歸為Others。在門水平上各土壤樣品優勢細菌均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)，總相對平均豐度達到61.85%左右，且不同區域的稻田土壤存在較大的差異(圖1)，特別是在東鄉野生稻(DY)與栽培稻(Contrast)土壤之間差異更加明顯。由圖1可知不同區域的野生稻稻田土的微生物群落組成不相同，左側為Bray-Curtis距離聚類樹結構，樣品聚類越近，分支越短，表明樣品組成越相似。DY1與DY2細菌群落組成相似，變形菌門相對豐度最大，分別為36.82%、31.11%，其次為放線菌門(19.13%、14.56%)和綠彎菌門(10.21%、10.46%)。而雖然DY3與Contrast在同一分支上，但其樣品組成相似度相對較低，DY3點位以放線菌門相對豐度最高為34.29%，其次為變形菌門(28.71%)，再者是綠彎菌門(10.31%)和酸桿菌門(Actinobacteria,9.37%)。栽培稻土壤中酸桿菌門(Actinobacteria,13.85%)明顯高于野生稻中相對豐度。Latescibacteria(0.06%～1.93%) 、Omnitrophicaeota(0.01%～1.56%)和BRC1(0.01%～0.26%)為東鄉野生稻原生境土壤中特有細菌門；Candidatus-Adlerbacteria(0.32%)和 Tenericutes(0.005%)為栽培稻特有的細菌門。

屬水平的細菌相對豐度結果如圖2所示，Subgroup-18-unclassified(3.39%)、Bacteroidetes-vadinHA17-unclassified(3.22%)、Spirochaeta-2(2.97%)、Sva0485-unclassified(2.94%)和Syntrophaceae-unclassified(2.91%)是DY1水稻田土壤細菌優勢屬；DY2的土壤細菌優勢屬分別是Sva0485-unclassified(5.42%)，Aminicenantales-unclassified(5.13%)，Subgroup-18-unclassified(4.46%)，Syntrophaceae-unclassified(3.30%)，Thermodesulfovibrionia-unclassified(3.11%)；DY3的為Acidobacteriales-unclassified(10.00%)、Subgroup-2-unclassified(6.54%)、Candidatus-Koribacter(5.86%)、WPS-2-unclassified(5.29%)、Candidatus-Solibacter(3.84%)。而Contrast土壤中細菌優勢屬為Acidobacteria-unclassified(5.16%)、KD4-96-unclassified(3.05%)、Gemmatimonas(4.00%)、Ktedonobacterales-unclassified(3.58%)和Saccharimonadales-unclassified(3.40%)。

3.4 土壤固氮菌群落結構分析

通過基于功能基因的高通量測序，其有效數據中數據質量≥Q20的數據比例為94.90%～96.33%，數據質量≥Q30的數據比例為84.52%～88.51%，表明此次測序數據較好且可靠。observed-species、chao1指數高，說明樣品物種數目多；shannon、simpson指數高，說明物種豐度以及均勻度都很高，由表3可知，DY組無論從固氮菌物種數目還是物種豐度和均勻度來說都高于Contrast組，這表明東鄉野生稻田土壤中固氮菌的群落多樣性和豐度均高于栽培稻土壤中的。此次測序unclassified占比較大(79.00%～84.34%)，四個樣品共有三門，變形菌門(Proteobacteria)為優勢門四個樣點均有，相對豐度為14.53%～21.00%，其中DY3含量最高，占21%；綠菌門(Chlorobi)只有DY1(1.13%)和DY2(0.22%)有，而藍藻細菌門(Cyanobacteria)只有DY3(0.01%)和Contrast(0.03%)。不同樣點的優勢屬不盡相同，其中DY1的優勢屬為慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,7.47%)、Pseudacidovorax(1.81%)、綠棒菌屬(Chlorobaculum,1.13%)，DY2的優勢屬為慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,13.66%)、固氮螺菌屬(Azospira,1.80%)、Pseudacidovorax(1.01%)；DY3的優勢屬為慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,18.26%)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis,0.69%)、紅長命菌屬(Rubrivivax,0.60%)；Contrast的優勢屬為慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,7.44%)、甲基球菌屬(Methylococcus,3.30%)、紅長命菌屬(Rubrivivax,3.30%)。Contrast存在兩種特有菌屬，為根瘤菌屬(Azorhizobium,0.11%)、微鞘藻屬(Microcoleus,0.03%)。

圖1 不同區域稻田土壤細菌群落結構特征及Bray-Curtis距離聚類樹(門水平，前30)

圖2 不同區域稻田土壤細菌群落結構特征(屬水平，前30)

3.5 環境因子對水稻土微生物結果的影響

使用冗余分析(redundancy analysis，簡稱RDA)分析部分的環境因子對四個水稻田土壤樣品的關系。圖3為土壤樣品在屬水平的前十個屬與環境因子(速效磷、速效鉀、堿解氮)的關系分析。由圖3的橫縱軸線分別可解釋總變化70.15%和27.57%，這表明此次所選的環境因子可以較好的揭示對細菌群落的影響，四個樣品在四個不同象限，這表明四個樣品間細菌群落結構差異顯著。環境因子箭頭越長說明對細菌群落的影響越大，夾角越小說明其相關性越大[11～13]。速效磷和速效鉀與Candidatus-Koribacter、KD4-96-unclassified、Acidobacteria-unclassified、Candidatus-Solibacter呈正相關，而與Acidobacteriales-unclassified、Subgroup-2-unclassified、ADurb.Bin063-1、Sva0485_unclassified、Aminicenantales-unclassified、Subgroup-18-unclassified呈負相關；堿解氮與Candidatus-Koribacter、Candidatus-Solibacter、Aminicenantales-unclassified、Subgroup-2-unclassified、KD4-96-unclassified、ADurb.Bin063-1呈正相關，而與Acidobacteria-unclassified、Acidobacteriales-unclassified、Sva0485_unclassified、Subgroup-18-unclassified呈負相關。由圖4的橫縱軸線分別可解釋總變化50.3%和38.17%，這表明此次所選的環境因子可以較好的揭示對固氮菌群落的影響，圖4為固氮菌前10個屬與環境因子(速效磷、堿解氮、全氮)之間的RDA分析，速效磷與甲基球菌屬、紅長命菌屬、Pseudacidovorax、Paraburkholderia呈正相關，全氮與甲基球菌屬、紅長命菌屬、Paraburkholderia、甲基孢囊菌屬和慢生根瘤菌呈正相關，堿解氮與Paraburkholderia、甲基孢囊菌屬和慢生根瘤菌呈正相關。

圖3 環境因子與細菌群落結構RDA分析

圖4 環境因子與固氮菌群落結構RDA分析

4 結論與討論

近年來，有許多學者對野生稻的根系微生物群落組成進行研究，但對于野生稻原生境土壤微生物群落組成卻鮮有研究，本研究使用基于16S rDNA基因和功能基因的高通量測序手段對東鄉野生稻原生境土壤與栽培稻土壤中細菌和固氮菌的群落結構進行比較，揭示其之間是否具有差異。對土壤中氮磷鉀等營養物質而言，本研究表明東鄉野生稻田中除堿解氮外，速效磷、速效鉀和全氮含量均顯著小于栽培稻田，這和東鄉野生稻田中未施用肥料的結果是相吻合的，但與程寧寧等[14]對海南野生稻的養分狀況有所不同，這與兩地氣候與土壤的差異性有關；且不同區域的東鄉野生稻田土壤的氮磷鉀含量差別較大。對于土壤中細菌群落結構組成，東鄉野生稻原生境土壤與栽培稻土壤樣品中細菌OTU屬于61門157綱326目495科742屬，從土壤細菌的Alpha多樣性指數來看，東鄉野生稻原生境土壤中細菌多樣性指數和均勻度高于栽培稻土壤，Bulgarelli等[15]的研究證實了野生大麥根部細菌的多樣性顯著高于對照組，在戴菲[16]的研究中表明在冬季低溫季節東鄉野生稻根際土壤微生物總量略高于對照組的栽培稻土壤，這與我們采樣季節相符合。

東鄉野生稻原生境土壤與栽培稻土壤之間細菌群落結構組成差異明顯，且不同區域的野生稻原生境土壤中群落組成也不盡相同。在此次研究野生稻與栽培稻優勢菌門均為為變形菌門、放線菌門和綠彎菌門，但栽培稻的酸桿菌門相對豐度明顯高于東鄉野生稻土壤。在野生稻原生境土壤和栽培稻土壤中均存在特有的菌門，如Latescibacteria(0.06%～1.93%) 、Omnitrophicaeota(0.01%～1.56%)和BRC1(0.01%～0.26%)為東鄉野生稻原生境土壤中特有細菌門；Candidatus-Adlerbacteria(0.32%)和 Tenericutes(0.005%)為栽培稻特有的細菌門。而對于屬野生稻土壤和栽培稻中特有的屬分別有35個和104個。通過RDA分析可知，速效鉀、速效磷和堿解氮對土壤細菌群落影響顯著，與細菌屬的前十個屬相關性不同。對于固氮菌來說，從Shannon指數來看，東鄉野生稻土壤中固氮菌微生物多樣性高于栽培稻的。目前，查詢和鑒定固氮酶鐵蛋白nifH基因序列主要是NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。但由于世界范圍內卻反相關基礎研究數據的信息，有些情況得到的查詢結果為unclassified。此次研究中unclassified平均相對豐度占比為81.67%。此外，東鄉野生稻土壤中固氮菌的優勢屬為慢生根瘤菌、Pseudacidovorax和固氮螺菌屬，而栽培稻的優勢屬為慢生根瘤菌、甲基球菌屬和紅長命菌屬，且在栽培稻中存在兩種特有的根瘤菌屬和微鞘藻屬。由RDA分析可知，速效磷、堿解氮和全氮是影響土壤中固氮菌群落的主要影響因子。

總的來說，東鄉野生稻原生境土壤中氮磷鉀營養物質，除堿解氮外，均高于栽培稻土壤中的含量；野生稻原生境土壤中細菌多樣性和固氮菌多樣性均大于栽培稻土壤，而其中共有優勢菌門和優勢菌屬較多，獨有的優勢菌屬較少。東鄉野生稻原生境土壤中細菌優勢門為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)。栽培稻土壤中優勢門為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Actinobacteria)。東鄉野生稻土壤中固氮菌的優勢屬為慢生根瘤菌、Pseudacidovorax和固氮螺菌屬，而栽培稻的優勢屬為慢生根瘤菌、甲基球菌屬和紅長命菌屬。由RDA分析可知，堿解氮、速效磷和速效鉀是影響土壤細菌群落結構的主要影響因子，堿解氮、速效磷和全氮是影響土壤固氮菌細菌群落結構的主要影響因子。