miR-17-5p靶向PI3K/AKT信號通路調控皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的機制

郭金蘭 甘才斌 張潔 董明亮 馬新蘋

(新鄉市中心醫院皮膚科，河南 新鄉 453000)

皮膚鱗狀細胞癌是一種起源于皮膚或其附屬物的惡性腫瘤，已嚴重威脅人類的健康〔1〕。目前，臨床主要采用手術、放療、化療和聯合治療等治療方法，但由于這些治療方法的局限性，并未產生理想的治療效果〔2〕。因此，尋找具有更好療效的新治療方法顯得至關重要。miR-17-5p是miR-17-92基因簇的重要成員，研究〔3，4〕表明，miR-17-5p的異常表達與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲轉移密切相關。例如，miR-17-5p在口腔鱗狀細胞癌中表達明顯上調，miR-17-5p可通過抑制其下游靶基因SOCS6促進腫瘤細胞的增殖〔3〕；但miR-17-5p在三陰性乳腺癌中表達顯著下調，過表達miR-17-5p可通過靶向下調ETV1抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖和侵襲〔4〕。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路與癌癥的相關性研究是近年來的研究熱點。已有研究〔5～7〕表明，miRNA通過調控PI3K/AKT信號通路與膠質瘤、宮頸癌和甲狀腺乳頭狀癌等多種惡性腫瘤的發生發展有關。例如，miR-489通過靶向spin1介導的PI3K/AKT通路抑制膠質瘤細胞增殖，誘導膠質瘤細胞凋亡〔5〕；miR-383通過下調PARP2抑制PI3K-AKT-MTOR信號通路抑制宮頸癌的發生〔6〕；miRNA-148a通過STAT3和PI3K/AKT信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞生長〔7〕。但尚無miR-17-5p在皮膚鱗狀細胞癌的相關研究，且miR-17-5p能否通過介導PI3K/AKT信號通路參與調控皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡也尚未可知。因此，本研究探討miR-17-5p靶向PI3K/AKT信號通路對皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料與主要試劑、儀器 皮膚鱗狀細胞癌A431細胞和人永生化角質形成細胞HaCaT購自美國ATCC。DMEM培養基和胎牛血清購自賽默飛公司；LipofectamineTM2000轉染試劑和TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；Inhibitor-con、miR-17-5p inhibitor、WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1的構建和測序由上海生工公司提供；RIPA試劑、噻唑藍(MTT)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western印跡相關試劑均購自北京索萊寶公司。兔抗PIK3R1、p-AKT、p-PI3K、cyclinD1、Bcl-2和Bax抗體購于美國Abcam公司，兔抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于武漢博士德公司。胰島素樣生長因子(IGF)-1和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；酶標儀購自美國Thermo公司；實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈式反應(PCR)儀購自美國ABI公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2細胞培養與轉染 用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養A431和HaCaT細胞。定期觀察細胞生長情況，當細胞融合度達到80%時，用胰酶消化進行傳代。取對數生長期的A431細胞，以細胞密度為2×105個/孔接種于6孔板，當細胞融合度約為60%時，用LipofectamineTM2000將NC、Inhibitor-con和miR-17-5p inhibitor分別轉染A431細胞。于細胞培養箱常規培養48 h后，進行后續實驗分析。實驗分組如下：NC組，Inhibitor-con組、miR-17-5p inhibitor(轉染miR-17-5p inhibitor)組。為了進一步驗證miR-17-5p是通過抑制PI3K/AKT信號通路來調控皮膚鱗狀細胞癌細胞A431的增殖和凋亡，當A431細胞轉染miR-17-5p inhibitor 48 h后，用100 ng/ml的IGF-1〔8〕處理1 h，隨后進行后續實驗分析。實驗分為miR-17-5p inhibitor組(轉染miR-17-5p inhibitor)和miR-17-5p inhibitor+IGF-1組(轉染miR-17-5p inhibitor后，用IGF-1處理)。

1.3qRT-PCR檢測 利用TRIzol試劑從HaCaT細胞及各組A431細胞中提取總RNA，將其逆轉錄為cDNA，隨后以cDNA為模板，進行qRT-PCR擴增。所有引物由北京華大基因提供。以U6作為miR-17-5p的內參，用2-ΔΔCt方法計算miR-17-5p的相對表達量。引物序列如下：miR-17-5p上游引物：5′-CTCTTACAGTGCAGGTAGAAAA-3′，下游引物：5′-GAGC-AGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物：5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。

1.4MTT法檢測細胞增殖活力 將對數期A431細胞以每孔1×105個細胞數接種于96孔板，按照上述細胞轉染方法向A431細胞轉染miR-17-5p inhibitor或Inhibitor-con后，分別于轉染后0 h、24 h、48 h、72 h時間點向每孔中加入MTT試劑20 μl，繼續培養4 h后吸去孔內上清，向每孔中加入150 μl的DMSO，振蕩10 min至完全溶解，用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值(用空白孔進行調零)。為了證明IGF-1可以逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞增殖的影響，分別在轉染0 h、24 h、48 h、72 h后，用100 ng/ml的IGF-1處理1 h，然后按照上述步驟檢測細胞活力。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組A431細胞，用胰酶消化后離心，棄上清液，收集各組細胞，用預冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞2次，加入適量的1×結合緩沖液輕輕吹打重懸細胞，然后加入5 μl的Annexin V-FITC進行混勻，在室溫條件下避光孵育15 min后，加入5 μl的PI染色，隨后用流式細胞儀測定各組A431細胞的凋亡情況。

1.6Western印跡檢測 用RIPA細胞裂解液裂解各組A431細胞，提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，分別取30 μg各組細胞蛋白，煮沸5 min充分變性后，用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，當電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜，用10%的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入Western印跡洗滌液充分洗滌(3次×10 min/次)，分別加入稀釋好的抗PIK3R1、β-actin、p-AKT、p-PI3K、細胞周期素(Cyclin)D1、Bax和Bcl-2蛋白的一抗4℃孵育過夜后，Western印跡洗滌液充分漂洗(3次×10 min/次)，加入HRP標記的二抗室溫孵育膜1 h，Western印跡洗滌液充分漂洗(3次×10 min/次)后，用ECL試劑盒進行顯色，利用灰度分析軟件Image J對目的條帶進行分析(以β-actin為內參)。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預測數據庫Target Scan (http：//www.targetscan.org)預測miR-17-5p的靶基因。發現miR-17-5p的5′端可與PIK3R1的3′-UTR特異性結合，猜測PIK3R1是miR-17-5p的靶基因。為驗證這一猜想，構建野生型WT-PIK3R1和突變型MUT-PIK3R1的PIK3R1 3′-UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM2000將miR-17-5p和miR-con分別與WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1共轉染A431細胞，然后將各組A431細胞于細胞培養箱內培養48 h，收集各組細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟對各組A431細胞的熒光素酶活性進行檢測。

1.8統計學方法 利用SPSS19.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-17-5p在人永生化角質形成細胞HaCaT和皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中的表達 與HaCaT細胞中miR-17-5p表達量(0.81±0.12)比較，皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中(3.45±0.41)表達顯著上調(t=10.704，P=0.000)。表明miR-17-5p在皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中呈高表達，在人永生化角質形成細胞HaCaT中呈低表達。

2.2抑制miR-17-5p表達對A431細胞增殖的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞中miR-17-5p的表達顯著降低(P<0.001)。表明成功構建了抑制miR-17-5p表達的A431細胞株。與NC組和Inhibitor-con組相比，miR-17-5p inhibitor組A431細胞在0 h、24 h時間點細胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時A431細胞增殖活力顯著降低，CyclinD1蛋白的表達顯著降低(均P<0.01)，見表1和圖1。提示抑制miR-17-5p表達可抑制A431細胞的增殖。

表1 抑制miR-17-5p表達對A431細胞增殖的影響

1～3：NC組,Inhibitor-con組,miR-17-5p inhibitor組，圖2、4同圖1 Western印跡檢測抑制miR-17-5p表達后A431細胞CyclinD1的表達

2.3抑制miR-17-5p表達對A431細胞凋亡的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞的凋亡率顯著增加，促凋亡蛋白Bax的表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低(均P<0.001)。見圖2、表2。表明抑制miR-17-5p表達可促進A431細胞凋亡。

圖2 Western印跡檢測抑制miR-17-5p表達對A431細胞凋亡的影響

表2 抑制miR-17-5p表達對A431細胞凋亡的影響

2.4miR-17-5p靶向調控PIK3R1的表達 圖3A結果顯示，miR-17-5p與WT-PIK3R1的3′UTR之間存在特異性結合位點。野生型PIK3R1基因熒光素酶表達載體WT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共轉染A431細胞后，miR-17-5p組A431細胞熒光素酶活性較miR-con組明顯降低(P<0.01)；而突變型PIK3R1基因熒光素酶表達載體MUT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共轉染A431細胞后，miR-17-5p組A431細胞熒光素酶活性較miR-con組差異不顯著(P>0.05)。見圖3B、表3。與mimic-con組A431細胞PIK3R1蛋白的表達量(0.76±0.14)比較，miR-17-5p mimic組(0.32±0.05)顯著減低；與inhibitor-con組A431細胞PIK3R1蛋白表達量(0.71±0.11)比較，miR-17-5p inhibitor組(1.32±0.19)顯著升高(P<0.05)。提示PIK3R1是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p可負性調控PIK3R1的表達。

1～4:mimic-con組，miR-17-5p mimic組，inhibitor-con組，miR-17-5p inhibitor組;A：通過TargetScan對miR-17-5p和結合進行預測示意圖；B：Western印跡檢測PIK3R1蛋白表達圖3 miR-17-5p靶向調控PIK3R1的表達

表3 miR-con或miR-17-5p與報告質粒共轉染A431細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5抑制miR-17-5p表達對PI3K/AKT信號通路下游蛋白表達的影響 與NC組和Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞中p-AKT和p-PI3K蛋白的表達顯著降低(均P<0.001)。見圖4，表4。表明抑制miR-17-5p表達可抑制A431細胞中PI3K/AKT信號通路下游蛋白的表達。

圖4 Western印跡檢測p-AKT和p-PI3K蛋白的表達

表4 Western印跡檢測p-AKT和p-PI3K的蛋白表達

2.6PI3K/AKT信號通路激活劑IGF-1可以逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞的增殖抑制和凋亡促進作用 與Inhibitor-con組比較，miR-17-5p inhibitor組A431細胞在0 h、24 h時間點細胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時A431細胞增殖活力顯著降低，A431細胞凋亡率顯著升高，p-AKT和p-PI3K蛋白的表達顯著降低(均P<0.05)；與miR-17-5p inhibitor組比較，miR-17-5p inhibitor+IGF-1組A431細胞在0 h、24 h時間點細胞增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時A431細胞增殖活力顯著升高，A431細胞凋亡率顯著降低，p-AKT和p-PI3K蛋白的表達顯著升高(均P<0.05)。見圖5，表5，表6。以上結果表明，PI3K/AKT信號通路激活劑IGF-1可逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。

1～3:Inhibitor-con組、miR-17-5p inhibitor組、miR-17-5p inhibitor+IGF-1組圖5 Western印跡檢測p-AKT、 p-PI3K蛋白表達

表5 IGF-1處理轉染miR-17-5p inhibitor的A431細胞增殖和凋亡情況

表6 Western印跡檢測p-AKT、 p-PI3K蛋白表達

3 討 論

miR-17-5p屬于miR-17家族，編碼基因位于人類13q31和嚙齒類14qE4染色體上，已有研究〔9～11〕發現，miR-17-5p在宮頸癌中高表達，通過靶向轉化生長因子β受體(TGFBR)2促進宮頸癌的增殖和轉移；miR-17-5p還可通過靶向p21促進鼻咽癌細胞增殖和腫瘤發生。然而，在前列腺癌中，miR-17-5p表達下調，過表達miR-17-5p可抑制癌細胞的生長和雄激素受體的轉錄活性。PI3K/AKT信號通路是惡性腫瘤中最活躍的信號通路之一，PI3K由一個催化亞基和一個調節亞基構成，PIK3R1基因編碼的p85α是主要的調節亞基，p85α通過與催化亞基p110結合，抑制p110的催化活性，抑制PI3K/AKT通路的活化。PI3K/AKT信號通路相關基因的異常表達是多種惡性腫瘤發生發展的常見驅動因素。研究〔12～14〕發現，多種miRNA通過調控PI3K/AKT信號通路相關基因的表達影響癌癥的發生發展。如miR-106b和miR-93通過PI3K/AKT通路抑制PTEN來調控乳腺癌的進展〔12〕；miR-451通過下調PI3K/AKT通路抑制人結腸癌細胞生長〔13〕；miR-497通過靶向胰島素樣生長因子1受體(IGFR)1可抑制結腸癌細胞的存活、增殖和侵襲〔14〕。但miR-17-5p和PI3K/AKT信號通路在皮膚鱗狀細胞癌中作用尚不清楚。

PIK3R1的異常表達，可減少p85α對p110的抑制作用，甚至干擾p85α對其他基因的調控，導致PI3K/AKT信號通路的意外活化，促進腫瘤的發生發展〔15～17〕。本研究結果表明抑制miR-17-5p表達可能通過上調PIK3R1，增強p85α對p110的抑制作用，抑制PI3K/AKT信號通路的活化，進而抑制PI3K/AKT信號通路下游蛋白p-AKT和p-PI3K的表達，從而抑制A431細胞的增殖，促進其凋亡，IGF-1可逆轉抑制miR-17-5p表達對A431細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。王延東〔18〕研究發現，miR-455-3p.1也可通過靶向下調PIK3R1基因表達，促進p-AKT蛋白表達，促進腎透明細胞癌細胞增殖、侵襲與轉移。提示miR-17-5p可能通過下調PIK3R1基因，激活PI3K/AKT信號通路，促進p-AKT和p-PI3K蛋白的表達，參與皮膚鱗狀細胞癌的發生發展。