ApoE基因缺陷與SD大鼠急性腦缺血模型穩定性比較

王雄 鄔玉芹 陳紅 張武 何占平 陳澤谷 夏鷹 余丹 陳晶

(海口市人民醫院暨中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院，海南 海口 570208)

隨著分子生物學發展，利用基因缺陷動物建立相關模型已成為科研工作的重要方向〔1〕。本研究結合國內外多個實驗室建立缺血性腦卒中模型的經驗〔2～4〕，利用改良線栓法建立載脂蛋白(Apo)E基因缺陷大鼠和野生型大鼠局灶性缺血模型，依據建模成功率、神經功能評分、磁共振成像(MRI)影像學表現對模型的成功率和穩定性進行評價，旨在探討建立穩定的腦卒中動物模型，更好地為缺血性腦卒中機制研究和治療效果的評價提供切實可行的基礎和前提。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選用雄性ApoE(-/-)基因剔除大鼠100只，SPF級雄性SD大鼠100只，年齡約6周齡且體重為0.18～0.22 kg，本實驗中使用的大鼠購自湖北省疾病預防控制中心，動物均可自由攝食標準飼料和自來水，置于12/12 h光/暗周期環境下24℃安靜溫控動物房籠中(每籠5只大鼠)飼養，相對濕度45%左右，通風良好，每籠3～5只飼養，依據大鼠品系分為兩組。

1.2動物模型制備 局灶性腦缺血再灌注模型制作參照文獻等〔5〕方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,根據文獻等〔6,7〕的5分制評分標準，本研究評分采用雙盲法，由未參與實驗分組者完成，防止選擇偏倚影響實驗結果的準確性。本實驗選擇2～3分模型作為實驗對象。對照組和實驗組動物模型均在術后3 d和7 d再次進行評分，評價神經功能狀態。腦梗死灶范圍測量采用雙盲法用圖像處理軟件(Image-Pro Plus6.0)測量和計算梗死腦組織的體積百分比，MRI數據采集使用美國GE公司signa HDX 3.0 T MR機掃描,上海辰光醫療科技有限公司生產的專用相控陣實驗動物線圈(大鼠，5 cm孔徑)對大鼠行顱腦MRI掃描。將兩組缺血性腦卒中動物模型均在缺血24 h、3 d和7 d時行MRI掃描，均行MRI-DWI、T2WI、PWI掃描，動態觀察不同MR掃描序列不同掃描時間的影像表現情況。

1.3缺血性腦卒中動物模型成功的神經病學標志 手術側表現出Honer征，出現強迫體態和對側前肢偏癱，爬行時向偏癱側轉圈、追尾現象等〔8〕。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1不同類別大鼠缺血性腦卒中動物模型行為學評分 ApoE基因缺陷組75只成功大鼠模型，缺血再灌注后3 d NSS評分顯著高于7 d(P<0.001)；缺血再灌注后3 d及7 d BWT評分無統計學差異(P=0.393)。SD組73只成功大鼠模型，缺血再灌注后3 d、7 d NSS、BWT評分差異有統計學意義(P<0.001)；見表1。

表1 兩組NSS、BWT評分比較分)

2.2MRI 在MR-DWI及T2WI圖像上均能看到缺血側與對側(非缺血側)影像存在明顯差異，但缺血區域均表現為明顯的高信號，兩組DWI序列顯示缺血灶邊界較T2WI更加清晰；ApoE基因缺陷組與SD組1、3、7 d腦缺血容積百分比分別為16.5%、18.5%、10.5%和9.0%、11.0%、5.5%，相同時點兩組間差異均有統計學意義(均P<0.05)；兩組缺血動物模型范圍先隨時間推移呈擴大趨勢，然后缺血范圍呈現不斷縮小趨勢；各時間點SD組缺血范圍均較ApoE組大且明顯，由缺血24 h到7 d內缺血灶變化范圍ApoE組更為明顯。兩種模型制作成功后MRI掃描清晰顯示大鼠腦組織缺血及水腫情況，T2WI和DWI均呈顯著高信號，于缺血手術后1 w水腫達高峰期，ApoE基因缺陷組與SD組1、3、7 d兩側大腦半球不對稱百分比分別為-4.5%、7.0%、6.5%和-5.0%、10.0%、-4.5%，相同時點兩組間差異均有統計學意義(P<0.05)。兩側大腦半球比值方向發生明顯變化。隨時間推移，水腫程度呈不同程度緩解，T2WI信號逐漸減低，以缺血灶周邊明顯，梗死中心區腦組織逐漸液化；彌散系數b=1 000時的DWI圖高信號為新鮮梗死區，缺血再灌注3 d內信號及缺血容積均呈上升趨勢，提示水腫逐漸加重，7 d后信號逐漸降低，提示水腫有所減輕。見圖1及圖2。

圖1 兩組腦卒中動物模型不同MRI掃描序列影像隨掃描時間的變化

圖2 兩組不同時點MRI-DWI

3 討 論

本研究結合國內外多個實驗室經驗，不斷優化實驗條件，ApoE基因缺陷大鼠與SD大鼠兩組模型3 d內成功率高分別為76%和77%。成模過程中大鼠死亡的原因多為蛛網膜下腔出血、麻醉過度、由于對氣道或迷走神經刺激過多過重致氣道分泌物多從而呼吸困難和窒息死亡、梗死面積過大〔9〕；神經功能缺損評分過低的大鼠可見腦部無梗死，可能為大腦中動脈閉塞不完全，早期出現不慎再灌注或梗塞范圍很小，多為大腦中動脈更小的分支供血區〔10〕。

通過Zea-Longa評分對ApoE基因缺陷與SD組MCAO模型的行為時間穩定性進行評價，術后ApoE基因缺陷大鼠模型NSS評分7 d比3 d有所降低，考慮與梗死后水腫逐漸改善致功能缺損有一定程度恢復有關，但橫木行走試驗改善不明顯，難度大的測試可以使恢復程度更難辨別；SD組NSS及WBT評分3 d與7 d差異明顯，神經功能評分從行為學角度說明SD大鼠模型的行為穩定性較ApoE轉基因大鼠MCAO模型的穩定性差。MRI-DWI的物質基礎是組織中水分子無規則的熱運動，也是目前測量活體水分子擴散運動成像的唯一方法。對兩種腦缺血動物模型均行MRI-DWI掃描，對比SD和ApoE(-/-)DWI影像發現，隨著時間推移SD組栓塞側腦組織高信號范圍變化較ApoE(-/-)大而明顯，特別是MRI灌注融合圖像能夠清晰顯示兩種模型的缺血核心和缺血半暗帶范圍差異。不少學者認為缺血半暗帶恢復血供后可恢復正常功能，不少學者認為缺血半暗帶的存在對于缺血再灌注和臨床溶栓時間窗的把握有重要意義〔5，11〕。MRI從形態影像學角度證實了SD大鼠模型形態影像的穩定性較Apo-E轉基因大鼠模型穩定性差。本研究結果顯示，ApoE基因缺陷大鼠模型的時間穩定性明顯優于SD大鼠模型。

綜上，可用ApoE基因缺陷大鼠制備穩定、可重復性強、操作相對簡單、創傷小、成功率高的大鼠模型，為進一步研究缺血性腦卒中的病因病機及治療方法提供良好的技術支持。ApoE基因缺陷大鼠制備缺血性腦卒中動物模型，與人群常見缺血性卒中發病過程類似，且穩定性較好，能夠很好地模擬人缺血性腦卒中發病的病理生理機制，在腦卒中機制和臨床研究中有廣闊的應用前景。