老年病樣本庫生物安全管理

傅蕾 保志軍 茍海昕

(1復旦大學附屬華東醫院中心實驗室，上海 200040;2上海市老年醫學臨床重點實驗室;3復旦大學附屬華東醫院傷外科)

隨著生命科學研究進入了功能基因組時代，人類對疾病狀態分子機制的不斷研究，疾病診斷和治療由傳統的疾病治療模式進入轉化醫學模式。規范化的老年病樣本庫建設和管理，提供高質量的樣本和完整臨床信息服務是老年醫學的基礎。作為質量管理體系中重要的組成部分，安全管理體系的建設和完善是樣本質量的最基本保證。生物樣本庫生物安全日益受到重視，為確保老年病樣本庫在生物安全前提下正常運行，本文旨在探討老年病樣本庫安全管理體系的建立和優化，工作流程的規范化管理，個人和樣本存儲環境的生物安全措施。

1 資料與方法

1.1研究對象 生物樣本庫以老年病的防治、抗衰老研究為主要方向,樣本均來自復旦大學附屬華東醫院各臨床科室住院和門診≥60歲患者及體檢人群。

1.2研究方法 專職人員培訓樣本庫有專職人員管理。按照《實驗室生物安全通用要求》(GB 19489-2008)中的實驗室人員管理要求對樣本庫人員在實驗室管理體系、安全知識及技能、實驗室設施設備(包括個體防護裝備)的安全使用和我院樣本庫設立的工作流程等方面組織培訓，考核合格后上崗。樣本庫基礎建設進行生物風險評估，同時參照《微生物和生物醫學實驗室生物安全通用準則》(WS233-2002)中的“實驗室生物安全防護水平分級與分類”，根據我院樣本庫基礎建設條件、處理樣本的類型和操作流程等，老年病樣本庫按照生物安全二級實驗室(BSL-2)建設〔1,2〕。樣本庫布局做到：①生物安全分區。按照生物安全的防護要求，老年病樣本庫的場地進行生物安全的分區設置，樣本庫內設置4～80℃預入庫區。接收處理的樣本統一放置臨時存儲區做預入庫。設置清潔區、半污染區和污染區。清潔區包括辦公室和耗材存儲室；半污染區包括常溫和低溫樣本存儲室、超低溫樣本存儲室；污染區包括樣本接收區、樣本處理區、污物處理間和質控室。各區貼醒目的標識。②人流和物流分開，人流從清潔區進入，物流(樣本流)從污染區進入。在物流入口粘貼“生物污染”標識。

1.3建立和優化安全管理體系 根據中國醫藥生物技術協會生物樣本庫標準(試行) 和國際生物和環境樣本庫協會(ISBER) 出版的(Best Practices for Repositories) 國際公認的樣本庫管理規范，建立老年病樣本庫的質量管理控制體系文件，編制質量手冊，包含 QA/QC 的所有流程。優化其中的安全管理體系文件，包括人員安全、設施及設備維護、樣本安全、意外事故應急處理方案等方面內容。

1.3.1建立樣本庫標準化操作流程 從樣本的收集、運輸、處理、存儲、使用等方面全程進行質量控制。樣本庫標準化流程見圖1。

1.3.2樣本采集 取樣人員需佩戴外科口罩或N95口罩、工作服、乳膠手套等防護用品。采樣前打印二維碼貼好采樣管和樣本采集表。采樣后樣本采集管外壁和轉運箱噴灑消毒液。在樣品采集方面主要遵循以下幾點〔3〕：①嚴格按照標準的采樣程序；②收集足夠量的生物材料以滿足所有檢測的需求；③對樣本進行嚴格標識，標識內容包括來源病人的姓名、編號、標本來源、采集時間及采集人員的姓名等信息。

圖1 樣本庫標準化流程

1.3.3樣本運輸和接收 轉運人員按一級生物安全防護要求著裝，將消毒后空轉運設備置于取樣處臨時存放點，收集裝有標本的轉運箱內噴灑2 000 mg/L含氯消毒液后加蓋密封與采樣人員交接，填寫樣本交接記錄。運輸過程中容器保持瓶口向上，保持設備平穩，避免劇烈振蕩顛簸、產生氣溶膠或劇烈震動導致標本溶血。轉運途中不要自行打開轉運箱，如有意外發生，到樣本庫接收點與樣本庫工作人員共同處理。社區流調樣本長距離運輸，需用生物樣本運輸專用車輛。為保持樣本活性,樣本采集后應盡快轉運至樣本保藏中心處理、凍存。若需要長途運輸無法在24 h內送達如跨省轉運樣本，保持在4～8℃。組織樣本迅速分割成適當大小和份數，加入適當的樣本保護液或直接放入液氮中快速冷凍保存。樣本接收時，工作人員按照一級生物安全防護要求著裝，樣本接收時對轉運箱包表面用75%酒精進行擦拭消毒后直接放置于4℃ 冰箱，將紙質樣本采集表、知情同意書、放入生物安全柜中進行紫外燈照射30 min。同時核對轉運清單,樣本采集表、知情同意書 標簽信息包括每一例患者流行病學史、姓名、登記號、采集時間等信息是否完整并簽字,以便回溯。樣本運輸人員領取已消毒后的運輸包用于再次運輸樣本。

1.4樣本處理 樣本處理和預入庫進入樣本庫污染區做好基本防護工作，包括穿隔離衣或防護服，佩戴護目鏡、手套、口罩、帽子及鞋套。對于無需開蓋二次處理的樣本在安全柜中消毒采樣管外壁后由入庫員標記，放入臨時存儲區-80℃隔離冰箱做預入庫。對于需要分裝和二次處理的樣本改為二級生物安全防護〔4〕,離心后的樣本管在生物安全柜中打開管帽處理、分裝入已貼二維碼凍存管，管外表面用75%酒精消毒擦拭后放入凍存盒內，凍存盒表面消毒后由入庫員二維碼掃描并在樣本庫信息管理系統中做預入庫，放入臨時存儲區。使用超低溫冰箱和液氮罐時，需佩戴防低溫手套。特別在操作液氮罐時，還需佩戴面罩或眼罩，防止液氮飛濺至臉部或眼睛。

1.5樣本數據錄入和入庫 老年病樣本庫對患者基本信息、流行病學史、病史、治療、隨訪資料完整錄入樣本數據庫，同時詳細錄入樣本類型、位置、編碼及從采集到存儲入庫的分析前變量(SPREC)〔5〕。在隨訪記錄中設置預入庫15 d后隨訪提醒，預入庫30 d后如無隨訪信息，作為失訪樣本銷毀處理。隨訪患者確定無高致病原微生物感染情況下樣本入庫轉入存儲區。

1.6樣本庫樣本共享和轉運安全 對樣本庫信息管理系統設置訪問權限，定期數據異地備份并定期進行數據維護以保證樣本庫數據安全。開放樣本庫信息管理系統的數據接口，和醫院信息管理系統連接，參與復旦大學系統網絡化樣本庫信息管理平臺建設，使樣本庫信息可被統一采集共享。樣本出庫時需簽署共享使用協議書后，方可執行樣本及數據出庫〔6〕。樣本出庫轉運時使用干冰或運輸液氮罐。樣本數據需去除姓名、性別、身份證號碼、醫保卡號等個人信息，保護患者隱私。盡量避免樣本庫數據存放到移動存儲設備，如需使用移動存儲設備，對數據進行加密處理，防止移動設備丟失后造成的倫理風險。

1.7建立應急預案 對樣本容器破裂、操作環境污染(生物安全柜內溢灑、離心機內溢灑等)及防護設備異常(如護目鏡起霧、防護設備松脫、手套破損及被液體樣本噴濺等)的突發情況參照實驗室生物危險物質溢灑處理指南〔4〕制定應急預案。同時制定超低溫冰箱應急處置預案，最大程度降低樣本庫安全風險。制定火災、水災、冰凍、地震、人為破壞等任何意外緊急情況下的應急預案，每年至少組織所有實驗室人員進行一次演習。

1.8建立樣本庫消毒制度 空氣消毒：室內自然通風，室內紫外燈照射每天2次，每次不少于30 min。根據消毒空間大小合理應用紫外線燈管數量及有效消毒距離。物體表面及地面消毒：每日中午和下班前使用1 000 mg/L含氯消毒液對地面、操作臺、儀器、門把手消毒，做好日常消毒記錄,若有污染物先用消毒濕紙巾除去再用2 000 mg/L含氯消毒液〔7〕。 生物安全操作柜和轉運箱消毒：二級生物安全柜操作空間每次使用前后用75%乙醇消毒,消毒后開啟紫外燈照射消毒30 min。轉運箱定期內部和外部清潔消毒(采用有效氯濃度為500 mg/L 的消毒液或75% 乙醇)。實驗室人員消毒：工作人員操作所有標本后進行手衛生消毒,所有個人防護用具原則上一次性使用不再回收，如需要重復回收使用的污染物品(護目鏡、隔離衣等)，用1 000 mg/L含氯消毒劑浸泡作用30 min〔8〕。

1.9醫療廢物處置 按照《醫療廢物管理條例》和《醫療衛生機構醫療廢物管理辦法》管理，患者所有標本當視為感染性醫療廢物,醫療廢物棄置于雙層醫療廢物包裝袋內，雙層封扎，用1 000 mg/L含氯消毒液噴灑袋外表面,從污物流通道轉交，由醫院統一處理。

2 結 果

2.1樣本的收集情況 自2013年建庫以來，入庫病例共7 609例，血清、血漿、血細胞、核酸、總蛋白、新鮮冰凍組織和石蠟組織等類型樣本共6萬多份，入庫病種主要為少肌癥、老年冠心病、老年高血壓、老年糖尿病、肝癌、肺癌、結腸癌、白塞病、帕金森病、阿爾茨海默病、脂肪肝等16個病種。約15 700份樣本已出庫用于臨床研究，樣本庫樣本使用率在26%左右。

2.2樣本的質量鑒定 按0.1%比例隨機抽取76例樣本，進行DNA和RNA檢測，結果顯示質檢樣本取材準確率在95%以上，DNA樣本OD260/OD280值為1.7～1.9；瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有DNA完整性良好，無降解。RNA樣本A260/280值均為1.9～2.0。 RNA經非變性電泳后，可見清晰的28 S和18 S條帶，且28 S/18 S在1.8 ～2.0 范圍內，說明RNA完整性較好，保存良好，樣本質量穩定，可以滿足老年病研究工作。

2.3老年病樣本庫 樣本庫在樣本采集、轉運、處理、保藏等工作流程中加入生物安全防護措施。建立和完善了安全管理體系文件，制定安全培訓計劃，對樣本庫工作人員進行安全培訓，落實樣本庫生物安全監督管理措施。我院老年病樣本庫在樣本收集、處理過程中對重要參數進行詳細記錄，規范地給每份樣本附上分析前因素，對樣本的質量進行追溯。保證了樣本庫生物的安全和老年病樣本庫的樣本質量。

3 討 論

樣本庫生物安全管理和安全管理體系的建立，對確保實驗室工作人員、公眾、樣本和環境安全十分重要。2003 年以來，國家逐漸重視生物安全，相繼頒發了《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《實驗室生物安全通用要求》等一系列法規，標志著我國樣本庫生物安全管理步入科學、規范發展階段。但由中國醫藥生物技術協會組織生物樣本庫分會(BBCMBA)開展的生物樣本庫質量達標檢查中發現了我國生物樣本庫現存的一些安全管理問題，如部分樣本庫場地規劃不分區、防護設施不完善、標識不健全等、生物安全制度不健全。樣本采集與處理標準操作規程(SOP)不符合樣本庫實際需求，操作與SOP 不一致，無異常情況應急預案等問題。

樣本庫是采集和存儲樣本、樣本臨床和生物學信息一體化的重要基礎研究共享平臺。樣本質量是生物樣本庫的核心，只有建設和完善質量管理體系中安全管理體系，優化樣本庫生物安全管理，提升樣本庫質量和自身能力，才能從根本上保障樣本質量。

我院老年病樣本庫成立生物安全管理委員會，專門負責制定生物安全方案和監督其實施情況，包括樣本的采集、處理、信息錄入、樣本存儲和銷毀等環節中生物安全防護措施和操作規范。建立和優化生物安全管理體系文件，制定應急預案。樣本庫工作人員進行規范化安全培訓。在實施過程中出現問題時，進行新的風險評估，采取糾正措施，及時改進識別，根據研究者反饋將改進措施加入生物安全管理文件。特別在樣本入庫時，使用SPREC〔5〕記錄樣本分析前的操作處理各環節信息，包括樣本來源和樣本跟蹤信息等重要參數。在質量管理體系中加入SPREC當樣本出庫使用或樣本共享研究時，研究者可明確獲得每份樣本附上的分析前因素，從而有效追溯和評估SPREC對樣本分子水平的影響，及對檢測結果的影響,有效保證了樣本的質量穩定。

老年病研究需要大樣本量，單一醫院的樣本庫無法完成樣本收集。但目前我國老年醫學研究生物樣本庫分散、樣本庫本身的質量不高，加之沒有按統一的標準規范建庫，使得樣本資源難以共享。只有按統一的標準規范建立老年病樣本庫，建立和完善生物安全管理體系，科學管理，定期重新評估和升級修訂生物安全方案并加以監督和實施，才能確保老年病樣本庫的生物安全。在保證樣本和數據安全的前提下，才能提供高質量的共享樣本資源，在盤活樣本庫現有存量，提高樣本使用率的同時，能更好地推動老年醫學及老年病研究發展和老年病樣本庫長期可持續發展。